细胞核微量制备试剂盒

特别提示：包括细胞核微量制备试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：细胞核微量制备试剂盒
英文名称：Nuclei Miniprep Kit
产品货号：BTN100601
产品规格：50次

用高密度介质来分离动物软体组织(如肝脏、脾脏等)细胞核是目前主流的方法，它是由Chauveau于1956年发明，其原理是细胞核的密度较大，在高速离心条件下(40000g 1小时)可在高密度介质(2.2mol/l 蔗糖溶液)中沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开的目的。该方法能通过一步离心得到较高纯度的细胞核，得到广泛应用。本产品就是在Chauveau方法的基础上优化改进而来。

产品特点：
1．基于密度梯度分离，可有效去除细胞质及其他细胞器，得到的细胞核纯净。
2．加进氯化钙、氯化镁、氯化*等改变分离介质渗透压的物质，减少了细胞核的脆性，增加了细胞核的完整性。
3．精心调节了介质的pH，防止细胞核在分离过程中的聚集，还能保持细胞核的精细结构。
4．快速，整个操作过程仅需1小时即可完成(对一个样品而言)。
5．提供染色试剂，可以在普通光学显微镜下检测纯化的细胞核的纯度。
6．处理温和，得到的细胞核中的大部分蛋白质都具有活性，可以用于胶迟阻实验、酶活性分析细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究；也可用于超大片段DNA的纯化。
7．不但适用于动物和植物培养细胞，还能用于实体组织(能用Dounce或Potter 匀浆器匀浆的组织均可)。
8．一次微量提取足够处理0.1 克组织或10E7个培养细胞，本产品足够50次微量提取。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A成分一	100ml
溶液A成分二(干粉)	约20g
溶液B成分一	50ml
溶液B成分二(干粉)	约100g
细胞核染色液	1套
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存，有效期一年。

使用方法：

一、准备工作：先将溶液A的成分二(干粉)全部加入到溶液A成分一(溶液)中，摇晃溶解后得到100mL溶液A。将溶液B的成分二(干粉)全部加入到溶液B成分一(溶液)中，摇晃溶解后得到50mL溶液B。4℃放置不能超过2 天，长期放置需要放-20℃。

二、微量细胞核分离(放量提取各试剂的用量可以按比例放大)：
1．对组织细胞：称取100～200mg 新鲜组织(如动物肝脏、脑、心肌和植物叶片等)，用自备的PBS或生理盐水洗净血水，滤纸吸干，用剪刀或刀片将其剪为碎块(zuì好大小为1cm3，过小反而不利于匀浆)放入小容量Dounce或Potter 玻璃匀浆器内。
2．对培养细胞：用自备胰酶按标准方法消化培养细胞，PBS 洗涤，800×g 5～10分钟离心收集细胞，计数。每次微量提取需要5×10E7个细胞，加入1.0mL预冷的溶液A重悬细胞，然后转移到小容量Dounce或Potter 玻璃匀浆器内
3．用Dounce或Potter 组织匀浆器在冰上破碎组织或细胞。如果用手动匀浆器，一般需要20～30次。如果用电动匀浆器，一般需要处理3-5次，每次5～10秒钟(转速为500r/min)。
4．将匀浆液转移到离心管中。如果匀浆液有可见的结缔组织和未破碎的组织块，可以用三层自备的纱布放在1.5mL离心管管口，将匀浆液过滤进入离心管。可取少量滤液涂在载玻片上制得涂片A，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
5．4℃，700-800×g 水平离心5-10分钟。细胞核沉淀在收集管底部，弃上清。可取少量上清液涂在载玻片上制得涂片B，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
6．加入0.5mL预冷溶液A重悬沉淀。用预冷的匀浆器(用前需要将表面的组织洗去)重悬沉淀。可取少量上清液涂在载玻片上制得涂片C，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
7．在水平型离心管中加入0.5mL预冷的溶液B，然后靠管壁慢慢加入上步得到的重悬液。
8．在4℃ 23000g离心30分钟，管底的沉淀即为细胞核。
9．小心吸弃上清液。注意：上清一般比较粘稠，zuì好倒立一段时间。
10．用0.5mL溶液A重悬沉淀。
11．在4℃ 1500g离心5分钟，吸弃上清，沉淀即为纯净的细胞核。可以直接使用，也可以加等体积的自备甘油，混匀后放液氮或-70℃保存。可取少量上悬浮液涂在载玻片上制得涂片D，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
12．用本方法一般可以从0.1g 肝脏组织中纯化到1-2×107个细胞核。如果后续试验是Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解细胞核后上样。

三、显微镜检测涂片，计算效率
1．将干燥后的A-D 四张涂片加入固定液固定15分钟，晾干。
2．Giemsa 染液染10分钟。
3．自备蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水。
4．用显微镜(40×)检查涂片，细胞核将呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。根据每步细胞核的数量可以粗略估计回收效率。

疑难解答：
本说明书强烈建议用离心力g 而不是转速计算所需的离心速度，因为不同的离心机转子直径不同，即使是同一转速，其离心力也不同。如果只知道转速，可用下式计算离心力。
G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２
G为离心力，一般以g(重力加速度)的倍数来表示；[rpm]２即转速的平方；
R为离心机转子的半径(单位为厘米)。

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