HAI-1 mRNA原位杂交试剂盒

特别提示：包括HAI-1 mRNA原位杂交试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：HAI-1 mRNA原位杂交试剂盒
英文名称：HAI-1 mRNA in situ hybridization kit
产品货号：ZN0627
产品规格：100T

基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.HAI-1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗*高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲*50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗*高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二*苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
HAI-1的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

除了HAI-1 mRNA原位杂交试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：DNA甲基化修饰试剂盒
货号：BTN130301
规格：150次
亚*酸氢盐修饰DNA时要求DNA必须在单链状态，反应还必须在低温进行，常规的修饰试剂盒由于是在液相进行，要在低温下让DNA不相互复性而保持单链状态非常棘手，所以常规修饰试剂盒的修饰效率一般都不高。此外，常规方法要切换反应液，有多次沉淀步骤，使得DNA的回收率一般都不超过50%。为克服这些缺点，本公司开发出了此升级产品。

产品特点：
1．用包埋的样品进行所有操作，免去所有沉淀和纯化步骤，极大简化了操作。
2．免去了DNA提取过程，所需实验材料比常规方法更少，zuì少几个细胞都可以，极大地节约了宝贵材料，尤其适用于珍稀材料。
3．包埋处理后，DNA在整个操作过程中都处于zuì适于修饰的单链状态，极大提高了修饰效率。
4．DNA包埋于包埋块中，切换反应液非常方便，而且DNA不会丢失，所以zuì终回收率都在90%以上。
5．适用于实体材料、悬浮细胞和纯化好的DNA样品。
6．本试剂盒足够制备150多个10μL包埋块(如果用纯化好的DNA)或25个10μL包埋块(如果用悬浮细胞)。

试剂盒组成：

成分	规格
包埋液	1.5ml
分子生物学级石蜡油	25ml
包埋块裂解液	12.5ml
蛋白酶K溶液(10mg/mL)	150μl
溶液A	30ml
溶液B成分一	2.3 g×5棕色瓶
溶液B成分二	110mg×5棕色管
TE缓冲液，pH8.0	125ml
说明书	1份

注: 包埋液用1.5mL旋盖离心管包装，溶液B成分一用5mL棕色瓶包装，溶液B成分二用1.5mL旋盖棕色管包装。

储存条件：低温运输、4℃保存、避免反复冻融，有效期一年。

使用方法：

一、准备试剂
1．在装有2.3g溶液B成分一干粉的瓶中加入3.9mL水和0.9mL溶液A，摇晃溶解得到4.8mL溶液B成分一。在装有110mg溶液B成分二干粉的离心管中加入1mL 50℃预热的超纯水，摇晃溶解，得到溶液B成分二。将0.6mL溶液B成分二加入到4.8mL溶液B成分一中，得到5.4mL溶液B，冰上放置待用。未用完的溶液B下次不得再使用。
2．每次实验前，将装有1.5mL包埋液离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液，然后放80℃待用。

二、对微量组织材料(如果材料足够，可先纯化DNA，再按第三方案进行)
1．用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞，得到浓度不超过60细胞/μL的单细胞PBS悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液(如卵细胞)，则PBS洗涤后直接离心沉淀，再重悬在PBS中(浓度不超过60细胞/μL)。注：本试剂盒不含本步所需相关试剂。
2．在一个2mL离心管中加入3μL细胞悬液，再迅速滴加7μL在 80℃预热的包埋液。注：不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。
3．加入500μL分子生物学级石蜡油，将离心管在沸冰浴中放置20分钟。
4．将离心管转移到冰上放置30分钟，低温下包埋液和细胞混合液将凝固成10μL的包埋块。
5．加入500μL包埋块裂解液和5μL Proteinase K溶液，37℃保温过夜。加入的溶液比重都比石蜡油大，将会自动沉降到石蜡油下层，不需离心。
6．吸弃包埋块之外的所有溶液(包括石蜡油)，用1mL TE缓冲液室温浸泡包埋块2次，每次15分钟。此步可去除残留包埋块裂解液。
7．酶切包埋块中的DNA：选定不识别PCR靶片段的内切酶(本试剂不提供该相关试剂)，再用100μL选定内切酶的1×缓冲室温液浸泡包埋块15分钟，吸弃缓冲液后再加入100μL选定内切酶的1×缓冲液和50U选定的内切酶，37℃保温2小时。
8．吸弃酶切反应液，再加入500μL新鲜配制的处理液A(配制方法：100μL溶液A+400μL超纯水)室温放置15分钟，重复此步一次。此时DNA将呈单链。
9．吸弃处理液A后，用1mL新鲜配制的处理液B(注：不是溶液B，配制方法：50μL溶液A+950μL超纯水)室温浸泡包埋块5分钟。
10．吸弃处理液B，加入750μL石蜡油，然后沸水浴20-30秒，使DNA单链彻底彼此分开。
11．奖离心管转移到冰上放置30分钟使包埋块重新凝固。
12．在离心管中加入1mL预冷的溶液B，溶液B将自动沉降到石蜡油下层。继续在冰上放置30分钟。此步用于修饰单链的DNA。
13．将离心管转移到50℃放置3.5小时。
14．吸弃溶液B，用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块2次，每次15分钟。
15．吸弃TE缓冲液，用500μL新鲜配制的处理液C(50μL溶液A+450μL超纯水)常温洗涤包埋块2次，每次15分钟。
16．吸弃处理液C，用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块3次，每次10分钟.
17．吸弃TE缓冲液，所得包埋块可以在4℃保存数月待用，也可以用超纯水洗涤两次(每次15分钟)后直接用做100μL体系甲基化PCR的模板。

三、对纯化好的DNA
18．选用不识别PCR靶片段的合适内切酶酶切纯化的基因组DNA(本试剂不提供所需试剂)，总体积不超过20μL，基因组DNA不超过700 ng。
19．酶切结束后，沸水浴5-10分钟灭活内切酶并变性DNA。
20．冰上放置并短暂离心数秒后，再加入4μL溶液A，50℃保温15分钟。
21．迅速加入50μL在80℃预热的包埋液，用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。
22．在一个新的2mL离心管中，加入1mL预冷的溶液B，再加上750μL石蜡油，并将离心管放冰上预冷。
23．迅速取80℃保温的混合液10μL，用在空中滴加的方式加到上步准备的预冷的离心管中，滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成包埋块并自动沉入管底，得到1个包埋块。注意：不要将枪头浸入到预冷的溶液中，否则包埋液将迅速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底，可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。
24．再重复上步操作6次(步骤23)，共可以得到7个包埋块(约含100ng DNA)。
25．将离心管(含7个包埋块)继续放冰上30分钟进行修饰。
26．后续操作同第13-17步。