2×Pfu MasterMix(含染料)

特别提示：包括2×Pfu MasterMix(含染料)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：2×Pfu MasterMix(含染料)
英文名称：2×Pfu MasterMix(With Dye)
产品货号：WE0108
产品规格：5ml

  本品为Pfu DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系，浓度为2×。Pfu DNA Polymerase具有5"-3"DNA聚合酶活性和5"-3"外切核酸酶活性的同时具有3"-5"外切核酸酶活性，因此在DNA扩增过程中具备纠错能力，是目前发现的错配率最低的耐高温DNA Polymerase。预配好的PCR混合液使操作更加简单快捷，可最大限度地减少人为误差和污染。*创的MasterMix配方使整个反应体系非常稳定，重复性好。本产品已加入染料(蓝色)，反应结束后可直接进行电泳检测，无需再使用上样缓冲液。本产品所含的Pfu DNA聚合酶具有错配率低，耐高温的特点，适用于基因克隆、基因定点突变、SNP和末端补平等反应。

产品组成：

组份	1ml	5ml
2×Pfu MasterMix(With Dye)	1ml	5×1ml
ddH2O	1ml	5×1ml

注意：2×Pfu MasterMix含有Pfu DNA Polymerase, 3 mM MgCl2和400μM each dNTP。

质量控制：
1、经检验无外源核酸酶活性；
2、PCR方法检测无宿主残余DNA；
3、能有效地扩增多种基因组中的单拷贝基因；
4、2～8℃存放三个月，活性无明显改变。

使用方法：
以下举例为以人基因组DNA为模板，扩增1 kb的片段的PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×Pfu MasterMix(With Dye)	25μl	1×
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：用Pfu酶扩增时，引物的纯度要求较高，引物长度大于18个碱基，引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

2、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	2 min
变性	94℃	30 s	25-35个循环
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	60 s
终延伸	72℃	5 min

注意：
1)Pfu酶的热稳定性比Taq酶好，对于GC含量很高的模板，变性温度可以提高到98℃，对Pfu酶的活性无影响。
2)一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
3)Pfu酶具有3"-5"外切酶活性，所以Pfu酶扩增时延伸速度远比Taq酶低，延伸时间根据所扩增片段大小设定，本产品的扩增延伸速率为1 kb/min。
4)可根据扩增产物的下游应用设定循环数。如果循环次数太少，扩增量不足；如果循环次数太多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以在保证产物得率的前提下应尽量减少循环次数。
5)本产品具有3"-5"外切核酸酶活性，PCR产物为平端不能直接用于T/A克隆，如需进行T/A克隆则需要在其末端添加“A”或用平末端载体进行克隆。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。

除了2×Pfu MasterMix(含染料),，我公司还供应以下相关产品：



名称：taq酶抗体
货号：BTN130815
规格：500U
Taq Antibody是Hot Start PCR用抗Taq抗体，其与Taq酶结合后抑制DNA聚合酶活性。使用本制品进行PCR扩增时，高温变性前抗Taq抗体与Taq酶结合抑制DNA聚合酶活性，能够在低温条件下有效抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增。抗Taq抗体在PCR反应最初的DNA变性步骤中变性，DNA聚合酶活性恢复，达到Hot Start PCR效果。使用本制品无需特殊的抗Taq抗体失活处理，可以在常规PCR反应条件下使用。其工作原理如下：


储存条件：低温运输，-20℃保存、有效期一年。

活性定义：Taq Antibody与Taq DNA Polymerase混合，25℃，10 min温浴后，在55℃，10 min条件下抑制90％以上的1U的Taq DNA Polymerase活性的Taq Antibody量定义为1U。

纯度：
1. 10 U的Taq Antibody和1μg的λDNA-Hind III在37℃或70℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
2. 10 U的Taq Antibody和1μg的Supercoiled pBR322 DNA在37℃或70℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
3. 10 U的Taq Antibody和1μg的λDNA在37℃或70℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
4. 10 U的Taq Antibody和1μg的16S，23S rRNA在37℃或70℃下反应1小时，RNA的电泳谱带不发生变化。
5. 35Cycles的PCR反应条件下，无Mouse Genomic DNA的污染。

名称：SuperSYBR Mixture(低含量ROX校正染料)
货号：WE0134
规格：1ml|5ml
  本品是专用于染料法(SYBR Green I)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×，包含 BaldStar Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I 荧光染料、Mg2+和ROX I 校正染料，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后cDNA靶序列的检测。
  本品所含的荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合，使该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。本品含有的BaldStar Taq DNA Polymerase是一种经化学修饰的、全新高效热启动酶，在常温下没有聚合酶活性，有效避免在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活须在95℃下孵育10分钟。独特的PCR缓冲体系与热启动酶的组合，有效抑制了非特异性的PCR扩增，显著提高了PCR的扩增效率。
  所含的ROX染料可校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，本试剂盒中ROX校正染料含量较较低，适用于ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等需要较低ROX信号校正的荧光定量PCR仪。

试剂盒组成：

组份	1ml	5ml
2×SuperSYBR Mixture(Low ROX)	1ml	5×1ml
ddH2O	1ml	5×1ml

产品特点
1、本产品中使用了全新高效热启动酶BaldStar Taq DNA Polymerase与独特的PCR缓冲体系，显著提高PCR的扩增效率，具有高灵敏度和特异性强的特点。
2、适用于荧光定量PCR检测，能够准确地对目的基因进行定量和检测。

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品中含有SYBR Green I荧光染料和ROX染料，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
3、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。
4、本品不能用于探针法荧光定量PCR。
5、配制反应液时，请使用新的或者无污染的枪头和离心管，尽量防止污染。

操作步骤：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×SuperSYBR Mixture(Low ROX)	2 5μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可得到较好结果，可以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
3)推荐反应体系为50μl，也可以根据实际实验需求按比例扩大或者缩小反应体系。

2、PCR反应程序：
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！

建议采用下表显示的两步法PCR进行程序设定，本程序是以ABI7500荧光定量PCR仪为例。若因Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR 扩增，三步法操作步骤详见《反应条件的优化》。
 

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	35-40 个循环
退火/延伸	60℃	1 min
融解曲线分析	95℃	15 s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2)退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。
3)本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定，融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定。

反应条件的优化：
在荧光定量反应条件优化时，应从引物浓度、退火温度、延伸时间等方面进行考虑，以提高反应特异性和扩增效率。
1、反应特异性和扩增效率高的实验体系应具备以下条件：
1)反应特异性高：阴性对照无引物二聚体等非特异性扩增；不产生目的片段以外扩增。
2)扩增效率高：Ct值低；PCR扩增效率高，接近理论值100%。
2、反应条件优化方法：
1)引物浓度：通常引物浓度以0.2μM可得到较好结果，可以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。若提高反应特异性，可降低引物浓度；若提高扩增效率，可增加引物的浓度，由此优化反应体系。
2)退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。若提高反应特异性，可提高退火温度，以60-64℃作为设定范围的参考。若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。
3)延伸时间：建议采用两步法PCR，延伸时间1 min进行反应。若提高扩增效率，可尝试将延伸时间增加，或尝试三步法PCR。
注意！本产品预变性反应必须在95℃ 10分钟下完成！

三步法荧光定量PCR(本程序是以ABI7500荧光定量PCR仪为例)：
 

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10 min
变性	95℃	10 s	35-40个循环
退火	56-64℃	30s
延伸	72℃	32s
融解曲线分析	95℃	15s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2)无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；发生非特异性反应时，提高退火温度。
3)若需提高反应扩增效率，可适当增加延伸时间。
4)本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定，融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定。

储存条件：-20℃，避免反复冻融