pMJ826大肠基因编辑质粒

质粒构建及提取概述

1、质粒的概念 质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，并通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因（如抗生素抗性基因）。质粒是分子生物学和基因工程中最重要的工具之一。 质粒根据其用途可以分为多种不同的类型，如用于保存序列信息的克隆质粒（如：pUC 系列质粒），用于表达蛋白的质粒（如哺乳动物细胞表达所用的 pcDNA3.1 系列质粒），用于基因编辑的质粒（如哺乳动物细胞基因编辑所用的 espCas9-2A

Cell Rep：上海科技大学季泉江团队开发出高效微型 CRISPR-SpaCas12f1 基因编辑系统

，即在靶向链上引入一个切口，非靶向链上引入两个切口（图 1）。 图 1. CRISPR-SpaCas12f1 的表征与改造 由于 SpaCas12f1 在大肠杆菌中拥有质粒干扰活性，为探究其能否成为一个在细菌中高效的基因组编辑工具，研究人员通过引入 SpaCas12f1 和 Lambda Red 重组酶系统及单链修复模板，实现了 CRISPR-SpaCas12f1 在大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中多种精准的基因组编辑

手把手教你学会 CRISPR Cas9 基因敲除技术

min。注：平末端连接效率较低，在连接体系中添加 PEG4000 可以提高连接效率。在连接体系中添加 EcoRV 酶可以显著提高阳性率。四、     转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 PCR 鉴定阳性克隆挑选阳性克隆进行测序验证, 验证正确后, 提取质粒进行转染试验, 关于 sgRNA 是否有效。可以转染之后，直接提取 DNA，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是 sgRNA 有效，如果没有则该 sgRNA 无效。