mEos3.2-Tubulin-C-18人源基因质粒

【求助】p85和p-ERK western检测问题

memoday 最近在做一个信号通路的下游磷酸化水平检测，但是做western没有看到任何条带,包括p-ERK,p85。麻烦各位战友帮我分析一下可能原因吧： 1.293T细胞转染质粒（带外源基因），24h 2.无血清培养18h 3.配体（外源基因是该配体的膜受体）激活，37度，10min 4.PLB（promega公司）裂解细胞，做western，抗体是SANTA CRUZ公司的p-ERK (Tyr 204)，以及cell

植物基因转化常用方法

，也很难找到单一的酶切位点。 d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA 的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。 加入植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物细胞启动子及末端polyA化信号，加入多聚人工接头以利于外源基因的。 植物中一般不存在质粒，为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。 2. 植物细胞转化的共整合系统 T-DNA 在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在

慢病毒载体基础知识及应用

毒载体。 2.慢病毒包装与纯化 慢病毒包装采用三质粒或四质粒系统进行包装，收集细胞培养上清，通过超速离心浓缩纯化和收集病毒。 3.慢病毒滴度检测 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组 4.慢病毒载体优势 ①  表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，实现基因长时间稳定的表达，不随细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选，常用于构建稳转株 ② 安全性高：未发现致病性，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T