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    研选NovoRec® Plus PCR一步定向克隆试剂盒

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    NovoRec® Plus PCR一步定向克隆试剂盒

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      • 货号:

        NR005-01A

      • 保存条件:

        -20℃

      • 规格:

        20次

      一、产品介绍:

      NovoRec® Plus PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)是近岸蛋白质科技最新研发的专利产品。该 产品可以不依赖于连接酶,不受载体和目的片段的酶切位点限制,而直接用同源重组的方 法,完成目的片段与载体相连接的基因克隆技术。该技术操作简单,PCR产物一步定向克 隆,目的片段与载体无缝连接,反应时间短至10分钟,阳性率达到95%以上,让您轻松完 成实验。

       

      二、保存条件:

       收到后请立即低速离心保存在-20℃;此kit可在-20℃长期保存,避免反复冻融。

       

      三、使用方法

      A、载体的制备:

      选取合适的位点,单酶切,双酶切或PCR扩增皆可,并且5’端突出,3’端突出或平末端均适用于本Kit。由于单酶切线性化程度差,且为了提高阳性率,我们建议您采取双酶切载体。最终载体的浓度需>15ng/μl 。(高浓度的载体有利于提高效率)。

      B、引物设计

      使用NovoRec® Plus PCR一步定向克隆试剂盒(无缝克隆)时,引物设计是很重要的,总的原则是通过引物5’端引入同源重组序列,扩增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具备能够相互同源重组的完全一致的序列。即在遵循引物设计基本原则的前提下,只需在上下游引物要加上15-20bp的载体同源序列。具体参考下图:

      blob.png

      C、目的片段的获得

      目的片段通常通过PCR获得,为保证PCR扩增的特异性及灵敏度,请尽可能选用pfu等高保真酶,推荐使用Novoprotein  Fast pfu DNA聚合酶(货号:E031)。PCR每条引物长度至少在40-45bp,包括5’端与载体同源的15-20bp以及目的片段特异性序列20-25bp(注意事项:如果是表达载体克隆构建,引物设计完成后,请注意检查读码框是否正确)。

      注:PCR扩增结束后如有杂带,需割胶回收,否则杂带会影响重组反应

      D、目的基因与载体的重组

      1.于冰盒上将目的片段与线性化载体以一定的摩尔比加入到离心管中进行重组反应(2-3个片段连接时,目的片段与载体的摩尔比为2:1,4-6个片段连接时,目的片段与载体的摩尔比为1:1)

      2.轻微混匀后,在50℃反应10分钟,如不慎将液体粘到管壁上,可通过短暂低速离心使其沉入管底。

      3.反应结束可直接进行转化,也可储存在4℃或-20℃。

        注:载体与片段的摩尔比为1:2时,载体加入量为50-100ng,可获得更高的重组效率;

        为了达到更高的组装效率,4-6片段连接建议各片段的引物同源臂长度大于20bp,各片段与载体的摩尔比为1:1(建议加入量为各0.05pmol),反应时间为30min-1h,不要将组装反应过夜;

        片段摩尔数的计算方法:pmols = (质量ng)×1000 / (base pairs×650 daltons)

        例:50ng 5000bp双链DNA是0.015pmols

       

      常用反应体系:

      blob.png

      E、反应产物转化、涂板

      我们建议所使用的感受态细胞效率要达到或>5×106cfu/μg。转化步骤如下:

      1.冰上融化一管100μl的DH5α感受态细胞,轻弹管壁使细胞重悬起来。加入10μl的反应液到感受态细胞中,轻弹数下,冰浴30min。

      2.42℃水浴中热激90秒后快速放入冰上5分钟。

      3.加入500μl  SOC或LB液体培养基,37℃孵育45-60分钟。

      4.5000rpm离心3分钟收集菌体,根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。

      注:为了验证载体酶切完全,建议在做转化同时做一个空载体作为对照。在载体处理好的情况下,对照应无克隆生长!

      blob.png   blob.png

      F、阳性克隆鉴定

      一般的,我们建议采用菌落PCR进行阳性克隆鉴定,推荐使用Novoprotein 2×specific Taq Master Mix( 货号:E010)。

      鉴定引物的选择:为了避免假阳性结果,我们建议一条引物为载体特异性引物,另一条引

      物为目的片段特异性引物。

      blob.png 

      泳道1-6:菌液PCR检测插入片段为4Kb的结果;

      泳道7:DL2000 Plus

      引用文献:
      Diterpenoid UDP-glycosyltransferases from Chinese Sweet Tea and Ashitaba Complete the Biosynthesis of Rubusoside
      https://www.cell.com/molecular-plant/abstract/S1674-2052(18)30188-6

       

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      上海市张江高科技园区蔡伦路720号2号楼

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      技术服务,试剂

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