新型钙离子荧光探针Calbryte 520, AM *细胞渗

 

 

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荧光显微镜
Ex:	FITC 滤波片组
Em：	FITC 滤波片组
推荐孔板:	黑色透明底板

 

 

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荧光酶标仪
Ex:	490 nm
Em：	525 nm
Cutoff：	515 nm
推荐孔板:	黑色透明底板
读取模式：	底读模式/可分液处理

使用Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯类

1.操作步骤

        Calbryte AM酯应在使用前在无水DMSO中重新配制。 DMSO储备溶液可以在-20℃下储存（干燥）并避光。 在这些条件下，AM酯应稳定三个月。 以下是我们推荐的将Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯加入活细胞的方案。 该方案仅提供指南，实际应根据您的特定需求进行修改。

a）在无水DMSO中制备2至5mM Calbryte 520AM，Calbryte 590AM或Calbryte 630AM酯的储备溶液。

b）将Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM溶解在DMSO中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。 在Hanks和Hepes缓冲液（HHBS）或您选择的缓冲液（0.04％Pluronic®F-127）中制备10至20μM的染料工作溶液。 细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。

注意：非离子型洗涤剂Pluronic®F-127有时用于增加Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM酯的水溶性。 各种Pluronic®F-127可从百萤购买。

c）如果您的细胞（如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，可将丙磺舒（1-2 mM）添加到染料工作溶液中（浓度为0.5-1 mM）

注意：各种ReadiUse 丙磺舒（包括水溶性钠盐和稳定溶液）均可从百萤购买。

d）将等体积的染料工作溶液（来自步骤b或c）加入细胞板中。

e）将染料加载板在细胞培养箱中孵育约60分钟，然后将板在室温下再孵育15分钟。

f）用HHBS或您选择的含有阴离子转运蛋白抑制剂（如1 mM丙磺舒）的缓冲液替换染料工作溶液，以去除多余的探针。

g）对于Calbryte 520 AM，在Ex / Em = 490 / 525nm处进行钙测试，对于Calbryte 590 AM，使用540/590nm进行钙测试，对于Calbryte 630 AM，使用610/640nm进行钙测试。

 

2.测量细胞内钙响应：

图1. CHO-K1细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 将CHO-K1细胞以每孔100μL每孔40,000个细胞接种过夜，在96孔黑色壁/透明底板中。将含有丙磺舒的HHBS中的100μLFluo-4AM或Calbryte 520AM加入孔中，并将细胞在37℃下孵育45分钟。 用200μLHHBS替换染料加载培养基，加入50μL50μMATP，并使用FITC通道用荧光显微镜（Keyence）成像。

图2.用Calbryte 520或Fluo-4 AM测量的CHO-M1细胞中外源M1受体的卡巴胆碱刺激的钙响应。 在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-M1细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。 将100μLFluo-4AM或不含丙磺舒的Calbryte 520AM加入细胞中，并将细胞在37℃下孵育45分钟。 通过FlexStation 3（Molecular Devices）添加Carbachol（50μL/孔）以达到终指示的浓度。

图3. CHO-K细胞中内源性P2Y受体对ATP的反应。 在96孔黑壁/透明底板中，将CHO-K细胞以每100μL/孔40,000个细胞接种过夜。 将100μL具有2mM丙磺舒的HbBS中的Calbryte 590AM或Calbryte  630 AM加入孔中，并将细胞在37℃下孵育1小时。 将染料加载培养基替换为200μLHHBS，用50μL50μMATP处理，并使用TRITC通道（Calbryte  590）和Texas Red Channel（Calbryte 630）用荧光显微镜（Keyence）成像。

 

结论

        由于Ca ²⁺在生物学中的重要性，已经建立了许多用于分析细胞和/或亚细胞Ca ²⁺活性机制的技术/方法。 尽管用于分析Ca ²⁺活性的每种方法都具有优于其他方法的某些优点，但每种方法也存在缺点。 凭借上述出色的性能，我们相信Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630钙检测试剂为各种生物系统中的细胞内钙分析和监测提供了新的强大工具。

        正如可能预测的那样，Ca^{2 +}分析中许多研究人员的兴趣从细胞水平转移到亚细胞水平。 已经发现Ca^{2 +}在整个细胞中均匀分布，并且在多种细胞（例如，卵母细胞，心肌细胞，肝细胞和外分泌细胞）中观察到Ca^{2 +}的细胞内异质性（例如Ca²⁺ waves and Ca²⁺ sparks）。 随着20世纪80年代共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和2000年代先进的酶标仪（如FLIPR，FDSS和NOVOStar专用于细胞内Ca^{2 +}检测）的出现，细胞内Ca^{2 +}的测量显着加速。 共聚焦激光扫描显微镜和近的多光子显微镜除了测量其浓度外，还允许在亚细胞水平上对细胞内Ca ²⁺信号传导进行的空间和时间分析。