Cytochrome P450 mRNA原位杂交试剂盒

特别提示：包括Cytochrome P450 mRNA原位杂交试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Cytochrome P450 mRNA原位杂交试剂盒
英文名称：Cytochrome P450 mRNA in situ hybridization kit
产品货号：ZN0375
产品规格：100T

基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human,rat,mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.Cytochrome P450 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗Digoxin 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%*聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%*聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%*聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯*醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%*聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%*聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Cytochrome的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

除了Cytochrome P450 mRNA原位杂交试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：萤火虫荧光素酶活性检测试剂盒
货号：BTN130597
规格：100次
本试剂盒采用通用裂解缓冲液，能与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容。本产品与海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒共同使用，可进行一体化的双荧光素酶检测。

报告基因检测是真核基因表达调控研究的常用方法。因为检测光量子的方法非常敏感，所以生物发光法是报告基因检测最常用的手段。荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。萤火虫荧光素酶催化的发光反应，具有很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达到10?2omol。原理如下：


试剂盒特点：
1．高度灵敏：可检测10?1?～10?2omol荧光素酶。
2．线性范围宽：线性范围达到7~8个数量级。
3．快速简便：特别适合于高通量筛选。
4．兼容性好：与其它常用报告基因检测试剂兼容。
5．本产品可足够100次荧光素酶检测。

试剂盒组成：

成分	规格
5×Universal Lysis Buffer (通用裂解缓冲液)	20mL
Fassay Buffer	10mL
Fassay Substrate(底物)	0.5mL
使用手册	1份

储存条件：低温运输，-20℃或-80℃避光保存，有效期半年。

使用方法：

★裂解细胞：
1. 配制裂解液：临用前，取适量5×Universal Lysis Buffer(ULB)，用双蒸水稀释至1×ULB，混匀。1×ULB可在4℃存放数周。
2. 清洗细胞：倾去培养板/皿中的培养液，加入足量PBS ，轻轻洗涤细胞。完全倾去洗涤液。
3. 裂解细胞：按照下表中推荐的体积，在孔/皿中加入1×ULB ，混匀。培养板可在微型振荡器上震荡5-10分钟；培养皿可直接用细胞刮刀刮下细胞，将细胞悬液移入1.5mL离心管，在涡旋振荡器上充分混悬震荡30秒。裂解细胞悬液可直接用于发光测定，也可离心30秒，取上清液做发光测定。
表：不同孔/皿所需1×ULB体积

96孔板	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	35mm平皿	60mm平皿
50μL	80μL	150μL	250μL	500μL	500μL	1000μL

★配制发光反应液：
测定前，室温溶化Fassay Buffer和Fassay Substrate，混匀。按20/1比例用Fassay Buffer稀释Fassay Substrate，配制所需体积的Fassay Reagent(注意避光)。
★测定仪器的设置：
按仪器操作说明开启发光测定仪。手动操作型仪器，将测读时间设为10~20秒。自动操作型仪器，一般将测定延迟设为2秒，将测读时间设为10~20秒，Fassay Reagent的注入体积设定为100μL。
★手动发光测定：
取待测样品20μl加入测量管底部，取Fassay Reagent 100μL立即加入管底部，轻轻敲击管壁3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)。如用多孔板同时手动测定多个样品，则将各待测样品20μL分别加入连续的各孔底部，用多道加样器于各孔底加入Fassay Reagent 100μL，轻轻敲击板侧3~5次混匀，放入仪器中立即测定，记录发光值为Firefly luciferase的发光单位(RLU)。
★自动发光测定：
配制好的Fassay Reagent置于测定仪内并连接好对应管道。取待测样品20μL分别加入测定管/板孔底部，启动自动测量程序。记录Firefly luciferase的发光单位(RLU)。

注意事项：
1．Fassay Substrate(底物)溶液应密封、盖严存放，避免蒸发。Fassay Buffer和Fassay Substrate(底物)应避免反复冻熔，可分装成合适体积分次使用。
2．1×细胞裂解液一般在当天测定。如需隔日测定，应将样品于-20℃保存。长期保存应在-80℃。
3．用多孔板同时手动测定多个样品时，要尽量缩短样品间试剂加入的时间间隔。
4．本产品与海肾荧光素酶活性检测试剂盒联合使用，可进行一体化的双荧光素酶检测。