pKD46大肠敲除质粒

【求助】质粒有两个复制起始点，怎么复制呢？（red重组，pKD46质粒）

mnidr 我现在在做基因敲除，用的是red重组系统，pKD46质粒上携带有敲除所需的蛋白。pKD46质粒上有两个复制起始点Origin of Replication：repA101ts & oriR101 ；repA101ts是温度敏感型复制起始点。 有几个问题请教： 1.大家有用过这个pKD46的吗？oriR101是温度敏感型复制子还是条件诱导型复制子啊，我在网上查到它是温度敏感型复制起始点，我很不理解，为什么已经有一个温度

【资源】质粒互换

敲除系统，氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因并在卡那霉素抗性基因两边带有 FRT 位点，为重组转化提供筛选标志 pKD13 基因敲除质粒 Kan 序列：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY048744.1 pKD46 基因敲除质粒 Chl 主要用于原核生物的基因敲除，Red

手把手教你学会 CRISPR Cas9 基因敲除技术

min。注：平末端连接效率较低，在连接体系中添加 PEG4000 可以提高连接效率。在连接体系中添加 EcoRV 酶可以显著提高阳性率。四、     转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 PCR 鉴定阳性克隆挑选阳性克隆进行测序验证, 验证正确后, 提取质粒进行转染试验, 关于 sgRNA 是否有效。可以转染之后，直接提取 DNA，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是 sgRNA 有效，如果没有则该 sgRNA 无效。