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- 保存条件：
-20
- 保质期：
2年
- 英文名：
pKD46
- 库存：
100
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 规格：
干粉/液体
基本信息
名称：pKD46大肠敲除质粒
别称: pKD46
质粒属性
质粒简介
pKD46质粒是目前应用最广泛的Red同源重组质粒，该质粒含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet、gam基因，其复制子为低拷贝温敏型复制子，便于质粒的消除。
与同源重组基因敲除相关的3个酶：
1、Exo蛋白：Exo蛋白是一种核酸外切酶，单亚基的分子量为24 kD，Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子，中间有一中空的通道，通道的一端可容纳双链DNA分子，另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端，从DNA双链的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用，具有介导互补单链DNA退火的功能，是一种退火蛋白，单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA的3’突出端，防止DNA被单链核酸酶降解，并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后，Beta蛋白从DNA双链上解离下来。
3、Gam蛋白：Gam蛋白为16kD的多肽分子，可与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其对外源DNA的降解作用，防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 6329 bp ds-DNA circular SYN 24-JUL-2017
DEFINITION synthetic circular DNA
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..6329
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
CDS complement(11..889)
/codon_start=1
/gene="araC"
/product="L-arabinose regulatory protein"
/note="araC"
/translation="MAEAQNDPLLPGYSFNAHLVAGLTPIEANGYLDFFIDRPLGMKGY
ILNLTIRGQGVVKNQGREFVCRPGDILLFPPGEIHHYGRHPEAREWYHQWVYFRPRAYW
HEWLNWPSIFANTGFFRPDEAHQPHFSDLFGQIINAGQGEGRYSELLAINLLEQLLLRR
MEAINESLHPPMDNRVREACQYISDHLADSNFDIASVAQHVCLSPSRLSHLFRQQLGIS
VLSWREDQRISQAKLLLSTTRMPIATVGRNVGFDDQLYFSRVFKKCTGASPSEFRAGCE
EKVNDVAVKLS"
promoter 916..1200
/gene="araBAD"
/note="araBAD promoter"
/note="promoter of the L-arabinose operon of E. coli; the
araC regulatory gene is transcribed in the opposite
direction (Guzman et al., 1995)"
CDS 1244..1660
/codon_start=1
/gene="gam"
/product="inhibitor of the host RecBCD nuclease in the
lambda Red system"
/note="Gam"
/note="protects the double-stranded DNA substrate for
recombination"
/translation="MDINTETEIKQKHSLTPFPVFLISPAFRGRYFHSYFRSSAMNAYY
IQDRLEAQSWARHYQQLAREEKEAELADDMEKGLPQHLFESLCIDHLQRHGASKKSITR
AFDDDVEFQERMAEHIRYMVETIAHHQVDIDSEV"
CDS 1666..2451
/codon_start=1
/gene="bet"
/product="single-stranded DNA binding recombinase in the
lambda Red system"
/note="Beta"
/note="mediates pairing of a single-stranded DNA with a
complementary target"
/translation="MSTALATLAGKLAERVGMDSVDPQELITTLRQTAFKGDASDAQFI
ALLIVANQYGLNPWTKEIYAFPDKQNGIVPVVGVDGWSRIINENQQFDGMDFEQDNESC
TCRIYRKDRNHPICVTEWMDECRREPFKTREGREITGPWQSHPKRMLRHKAMIQCARLA
FGFAGIYDKDEAERIVENTAYTAERQPERDITPVNDETMQEINTLLIALDKTWDDDLLP
LCSQIFRRDIRASSELTQAEAVKALGFLKQKAAEQKVAA"
CDS 2448..3128
/codon_start=1
/gene="exo"
/product="5' to 3' double-stranded DNA exonuclease in the
lambda Red system"
/note="Exo"
/note="creates 3' single-stranded DNA tails"
/translation="MTPDIILQRTGIDVRAVEQGDDAWHKLRLGVITASEVHNVIAKPR
SGKKWPDMKMSYFHTLLAEVCTGVAPEVNAKALAWGKQYENDARTLFEFTSGVNVTESP
IIYRDESMRTACSPDGLCSDGNGLELKCPFTSRDFMKFRLGGFEAIKSAYMAQVQYSMW
VTRKNAWYFANYDPRMKREGLHYVVIERDEKYMASFDEIVPEFIEKMDEALAEIGFVFG
EQWR"
terminator 3129..3373
/note="lambda tL3 terminator"
/note="transcription terminator tL3 from phage lambda"
CDS complement(3496..4446)
/codon_start=1
/gene="rep101"
/product="RepA protein needed for replication with the
pSC101 origin"
/note="Rep101"
/translation="MSELVVFKANELAISRYDLTEHETKLILCCVALLNPTIENPTRKE
RTVSFTYNQYAQMMNISRENAYGVLAKATRELMTRTVEIRNPLVKGFEIFQWTNYAKFS
SEKLELVFSEEILPYLFQLKKFIKYNLEHVKSFENKYSMRIYEWLLKELTQKKTHKANI
EISLDEFKFMLMLENNYHEFKRLNQWVLKPISKDLNTYSNMKLVVDKRGRPTDTLIFQV
ELDRQMDLVTELENNQIKMNGDKIPTTITSDSYLRNGLRKTLHDALTAKIQLTSFEAKF
L-SDMQSKYDLNGSFSWLTQKQRTTLENILAKYGRI"
rep_origin 4494..4716
/note="pSC101 ori"
/note="low-copy replication origin that requires the Rep101
protein"
CDS complement(5338..6198)
/codon_start=1
/gene="bla"
/product="beta-lactamase"
/note="AmpR"
/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
/translation="MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYI
ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(6199..6303)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
ORIGIN
1 catcgattta ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac
61 ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat
121 cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca
181 gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct
241 ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga
301 tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat
361 tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct
421 caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga
481 tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg
541 tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt
601 aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc
661 ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca
721 ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt
781 cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg
841 cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac
901 tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg
961 tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt
1021 aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca
1081 gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat
1141 ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat
1201 acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaaatggata ttaatactga
1261 aactgagatc aagcaaaagc attcactaac cccctttcct gttttcctaa tcagcccggc
1321 atttcgcggg cgatattttc acagctattt caggagttca gccatgaacg cttattacat
1381 tcaggatcgt cttgaggctc agagctgggc gcgtcactac cagcagctcg cccgtgaaga
1441 gaaagaggca gaactggcag acgacatgga aaaaggcctg ccccagcacc tgtttgaatc
1501 gctatgcatc gatcatttgc aacgccacgg ggccagcaaa aaatccatta cccgtgcgtt
1561 tgatgacgat gttgagtttc aggagcgcat ggcagaacac atccggtaca tggttgaaac
1621 cattgctcac caccaggttg atattgattc agaggtataa aacgaatgag tactgcactc
1681 gcaacgctgg ctgggaagct ggctgaacgt gtcggcatgg attctgtcga cccacaggaa
1741 ctgatcacca ctcttcgcca gacggcattt aaaggtgatg ccagcgatgc gcagttcatc
1801 gcattactga tcgttgccaa ccagtacggc cttaatccgt ggacgaaaga aatttacgcc
1861 tttcctgata agcagaatgg catcgttccg gtggtgggcg ttgatggctg gtcccgcatc
1921 atcaatgaaa accagcagtt tgatggcatg gactttgagc aggacaatga atcctgtaca
1981 tgccggattt accgcaagga ccgtaatcat ccgatctgcg ttaccgaatg gatggatgaa
2041 tgccgccgcg aaccattcaa aactcgcgaa ggcagagaaa tcacggggcc gtggcagtcg
2101 catcccaaac ggatgttacg tcataaagcc atgattcagt gtgcccgtct ggccttcgga
2161 tttgctggta tctatgacaa ggatgaagcc gagcgcattg tcgaaaatac tgcatacact
2221 gcagaacgtc agccggaacg cgacatcact ccggttaacg atgaaaccat gcaggagatt
2281 aacactctgc tgatcgccct ggataaaaca tgggatgacg acttattgcc gctctgttcc
2341 cagatatttc gccgcgacat tcgtgcatcg tcagaactga cacaggccga agcagtaaaa
2401 gctcttggat tcctgaaaca gaaagccgca gagcagaagg tggcagcatg acaccggaca
2461 ttatcctgca gcgtaccggg atcgatgtga gagctgtcga acagggggat gatgcgtggc
2521 acaaattacg gctcggcgtc atcaccgctt cagaagttca caacgtgata gcaaaacccc
2581 gctccggaaa gaagtggcct gacatgaaaa tgtcctactt ccacaccctg cttgctgagg
2641 tttgcaccgg tgtggctccg gaagttaacg ctaaagcact ggcctgggga aaacagtacg
2701 agaacgacgc cagaaccctg tttgaattca cttccggcgt gaatgttact gaatccccga
2761 tcatctatcg cgacgaaagt atgcgtaccg cctgctctcc cgatggttta tgcagtgacg
2821 gcaacggcct tgaactgaaa tgcccgttta cctcccggga tttcatgaag ttccggctcg
2881 gtggtttcga ggccataaag tcagcttaca tggcccaggt gcagtacagc atgtgggtga
2941 cgcgaaaaaa tgcctggtac tttgccaact atgacccgcg tatgaagcgt gaaggcctgc
3001 attatgtcgt gattgagcgg gatgaaaagt acatggcgag ttttgacgag atcgtgccgg
3061 agttcatcga aaaaatggac gaggcactgg ctgaaattgg ttttgtattt ggggagcaat
3121 ggcgatgacg catcctcacg ataatatccg ggtaggcgca atcactttcg tctactccgt
3181 tacaaagcga ggctgggtat ttcccggcct ttctgttatc cgaaatccac tgaaagcaca
3241 gcggctggct gaggagataa ataataaacg aggggctgta tgcacaaagc atcttctgtt
3301 gagttaagaa cgagtatcga gatggcacat agccttgctc aaattggaat caggtttgtg
3361 ccaataccag tagaaacaga cgaagaatcc atgggtatgg acagttttcc ctttgatatg
3421 taacggtgaa cagttgttct acttttgttt gttagtcttg atgcttcact gatagataca
3481 agagccataa gaacctcaga tccttccgta tttagccagt atgttctcta gtgtggttcg
3541 ttgtttttgc gtgagccatg agaacgaacc attgagatca tacttacttt gcatgtcact
3601 caaaaatttt gcctcaaaac tggtgagctg aatttttgca gttaaagcat cgtgtagtgt
3661 ttttcttagt ccgttacgta ggtaggaatc tgatgtaatg gttgttggta ttttgtcacc
3721 attcattttt atctggttgt tctcaagttc ggttacgaga tccatttgtc tatctagttc
3781 aacttggaaa atcaacgtat cagtcgggcg gcctcgctta tcaaccacca atttcatatt
3841 gctgtaagtg tttaaatctt tacttattgg tttcaaaacc cattggttaa gccttttaaa
3901 ctcatggtag ttattttcaa gcattaacat gaacttaaat tcatcaaggc taatctctat
3961 atttgccttg tgagttttct tttgtgttag ttcttttaat aaccactcat aaatcctcat
4021 agagtatttg ttttcaaaag acttaacatg ttccagatta tattttatga atttttttaa
4081 ctggaaaaga taaggcaata tctcttcact aaaaactaat tctaattttt cgcttgagaa
4141 cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc aaagccttta accaaaggat tcctgatttc
4201 cacagttctc gtcatcagct ctctggttgc tttagctaat acaccataag cattttccct
4261 actgatgttc atcatctgag cgtattggtt ataagtgaac gataccgtcc gttctttcct
4321 tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag cataaaatta gcttggtttc
4381 atgctccgtt aagtcatagc gactaatcgc tagttcattt gctttgaaaa caactaattc
4441 agacatacat ctcaattggt ctaggtgatt ttaatcacta taccaattga gatgggctag
4501 tcaatgataa ttactagtcc ttttcctttg agttgtgggt atctgtaaat tctgctagac
4561 ctttgctgga aaacttgtaa attctgctag accctctgta aattccgcta gacctttgtg
4621 tgtttttttt gtttatattc aagtggttat aatttataga ataaagaaag aataaaaaaa
4681 gataaaaaga atagatccca gccctgtgta taactcacta ctttagtcag ttccgcagta
4741 ttacaaaagg atgtcgcaaa cgctgtttgc tcctctacaa aacagacctt aaaaccctaa
4801 aggcttaagt agcaccctcg caagctcggt tgcggccgca atcgggcaaa tcgctgaata
4861 ttccttttgt ctccgaccat caggcacctg agtcgctgtc tttttcgtga cattcagttc
4921 gctgcgctca cggctctggc agtgaatggg ggtaaatggc actacaggcg ccttttatgg
4981 attcatgcaa ggaaactacc cataatacaa gaaaagcccg tcacgggctt ctcagggcgt
5041 tttatggcgg gtctgctatg tggtgctatc tgactttttg ctgttcagca gttcctgccc
5101 tctgattttc cagtctgacc acttcggatt atcccgtgac aggtcattca gactggctaa
5161 tgcacccagt aaggcagcgg tatcatcaac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc
5221 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa
5281 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta
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5821 ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt
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6121 ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg
6181 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta
6241 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc
6301 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctg
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
名称：pKD46大肠敲除质粒
别称: pKD46
| 启动子: | araBAD |
|---|---|
| 复制子: | pSC101 |
| 终止子: | λ tL3 terminator |
| 原核抗性: | Amp |
| 克隆菌株: | DH5a |
| 培养条件: | 30度 |
| 表达宿主: | 大肠杆菌 |
| 诱导方式: | 阿拉伯糖 |
质粒属性
| 载体宿主： | 大肠杆菌 |
|---|---|
| 载体用途： | 基因敲除 |
| 基因种属： | |
| 基因类型： | Red |
| 原核抗性： | Amp |
| 真核抗性： | |
| 荧光蛋白： |
质粒简介
pKD46质粒是目前应用最广泛的Red同源重组质粒，该质粒含有受阿拉伯糖启动子调控的exo、bet、gam基因，其复制子为低拷贝温敏型复制子，便于质粒的消除。
与同源重组基因敲除相关的3个酶：
1、Exo蛋白：Exo蛋白是一种核酸外切酶，单亚基的分子量为24 kD，Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子，中间有一中空的通道，通道的一端可容纳双链DNA分子，另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端，从DNA双链的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用，具有介导互补单链DNA退火的功能，是一种退火蛋白，单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA的3’突出端，防止DNA被单链核酸酶降解，并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后，Beta蛋白从DNA双链上解离下来。
3、Gam蛋白：Gam蛋白为16kD的多肽分子，可与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其对外源DNA的降解作用，防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。
质粒图谱
质粒序列
LOCUS Exported 6329 bp ds-DNA circular SYN 24-JUL-2017
DEFINITION synthetic circular DNA
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..6329
/organism="synthetic DNA construct"
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araC regulatory gene is transcribed in the opposite
direction (Guzman et al., 1995)"
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lambda Red system"
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lambda Red system"
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pSC101 origin"
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RTVSFTYNQYAQMMNISRENAYGVLAKATRELMTRTVEIRNPLVKGFEIFQWTNYAKFS
SEKLELVFSEEILPYLFQLKKFIKYNLEHVKSFENKYSMRIYEWLLKELTQKKTHKANI
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ELDRQMDLVTELENNQIKMNGDKIPTTITSDSYLRNGLRKTLHDALTAKIQLTSFEAKF
L-SDMQSKYDLNGSFSWLTQKQRTTLENILAKYGRI"
rep_origin 4494..4716
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/note="low-copy replication origin that requires the Rep101
protein"
CDS complement(5338..6198)
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/note="confers resistance to ampicillin, carbenicillin, and
related antibiotics"
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ELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRIDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYS
PVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRW
EPELNEAIPNDERDTTMPVAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSA
LPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGAS
LIKHW"
promoter complement(6199..6303)
/gene="bla"
/note="AmpR promoter"
ORIGIN
1 catcgattta ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac
61 ggaactcgct cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat
121 cgtcaaaacc aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca
181 gcttcgcctg gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct
241 ggcggaaaag atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga
301 tatcaaaatt gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat
361 tatccatcgg tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct
421 caagcagatt tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga
481 tttgcccaaa caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg
541 tattggcaaa tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt
601 aaacccactg gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc
661 ctggcgggaa cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca
721 ccaccccctg accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt
781 cgataaaaaa atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg
841 cattaaacga gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac
901 tcccgccatt cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg
961 tcttttactg gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt
1021 aacaaagcgg gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca
1081 gaaaagtcca cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat
1141 ccataagatt agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gtttctccat
1201 acccgttttt ttgggaattc gagctctaag gaggttataa aaaatggata ttaatactga
1261 aactgagatc aagcaaaagc attcactaac cccctttcct gttttcctaa tcagcccggc
1321 atttcgcggg cgatattttc acagctattt caggagttca gccatgaacg cttattacat
1381 tcaggatcgt cttgaggctc agagctgggc gcgtcactac cagcagctcg cccgtgaaga
1441 gaaagaggca gaactggcag acgacatgga aaaaggcctg ccccagcacc tgtttgaatc
1501 gctatgcatc gatcatttgc aacgccacgg ggccagcaaa aaatccatta cccgtgcgtt
1561 tgatgacgat gttgagtttc aggagcgcat ggcagaacac atccggtaca tggttgaaac
1621 cattgctcac caccaggttg atattgattc agaggtataa aacgaatgag tactgcactc
1681 gcaacgctgg ctgggaagct ggctgaacgt gtcggcatgg attctgtcga cccacaggaa
1741 ctgatcacca ctcttcgcca gacggcattt aaaggtgatg ccagcgatgc gcagttcatc
1801 gcattactga tcgttgccaa ccagtacggc cttaatccgt ggacgaaaga aatttacgcc
1861 tttcctgata agcagaatgg catcgttccg gtggtgggcg ttgatggctg gtcccgcatc
1921 atcaatgaaa accagcagtt tgatggcatg gactttgagc aggacaatga atcctgtaca
1981 tgccggattt accgcaagga ccgtaatcat ccgatctgcg ttaccgaatg gatggatgaa
2041 tgccgccgcg aaccattcaa aactcgcgaa ggcagagaaa tcacggggcc gtggcagtcg
2101 catcccaaac ggatgttacg tcataaagcc atgattcagt gtgcccgtct ggccttcgga
2161 tttgctggta tctatgacaa ggatgaagcc gagcgcattg tcgaaaatac tgcatacact
2221 gcagaacgtc agccggaacg cgacatcact ccggttaacg atgaaaccat gcaggagatt
2281 aacactctgc tgatcgccct ggataaaaca tgggatgacg acttattgcc gctctgttcc
2341 cagatatttc gccgcgacat tcgtgcatcg tcagaactga cacaggccga agcagtaaaa
2401 gctcttggat tcctgaaaca gaaagccgca gagcagaagg tggcagcatg acaccggaca
2461 ttatcctgca gcgtaccggg atcgatgtga gagctgtcga acagggggat gatgcgtggc
2521 acaaattacg gctcggcgtc atcaccgctt cagaagttca caacgtgata gcaaaacccc
2581 gctccggaaa gaagtggcct gacatgaaaa tgtcctactt ccacaccctg cttgctgagg
2641 tttgcaccgg tgtggctccg gaagttaacg ctaaagcact ggcctgggga aaacagtacg
2701 agaacgacgc cagaaccctg tttgaattca cttccggcgt gaatgttact gaatccccga
2761 tcatctatcg cgacgaaagt atgcgtaccg cctgctctcc cgatggttta tgcagtgacg
2821 gcaacggcct tgaactgaaa tgcccgttta cctcccggga tttcatgaag ttccggctcg
2881 gtggtttcga ggccataaag tcagcttaca tggcccaggt gcagtacagc atgtgggtga
2941 cgcgaaaaaa tgcctggtac tttgccaact atgacccgcg tatgaagcgt gaaggcctgc
3001 attatgtcgt gattgagcgg gatgaaaagt acatggcgag ttttgacgag atcgtgccgg
3061 agttcatcga aaaaatggac gaggcactgg ctgaaattgg ttttgtattt ggggagcaat
3121 ggcgatgacg catcctcacg ataatatccg ggtaggcgca atcactttcg tctactccgt
3181 tacaaagcga ggctgggtat ttcccggcct ttctgttatc cgaaatccac tgaaagcaca
3241 gcggctggct gaggagataa ataataaacg aggggctgta tgcacaaagc atcttctgtt
3301 gagttaagaa cgagtatcga gatggcacat agccttgctc aaattggaat caggtttgtg
3361 ccaataccag tagaaacaga cgaagaatcc atgggtatgg acagttttcc ctttgatatg
3421 taacggtgaa cagttgttct acttttgttt gttagtcttg atgcttcact gatagataca
3481 agagccataa gaacctcaga tccttccgta tttagccagt atgttctcta gtgtggttcg
3541 ttgtttttgc gtgagccatg agaacgaacc attgagatca tacttacttt gcatgtcact
3601 caaaaatttt gcctcaaaac tggtgagctg aatttttgca gttaaagcat cgtgtagtgt
3661 ttttcttagt ccgttacgta ggtaggaatc tgatgtaatg gttgttggta ttttgtcacc
3721 attcattttt atctggttgt tctcaagttc ggttacgaga tccatttgtc tatctagttc
3781 aacttggaaa atcaacgtat cagtcgggcg gcctcgctta tcaaccacca atttcatatt
3841 gctgtaagtg tttaaatctt tacttattgg tttcaaaacc cattggttaa gccttttaaa
3901 ctcatggtag ttattttcaa gcattaacat gaacttaaat tcatcaaggc taatctctat
3961 atttgccttg tgagttttct tttgtgttag ttcttttaat aaccactcat aaatcctcat
4021 agagtatttg ttttcaaaag acttaacatg ttccagatta tattttatga atttttttaa
4081 ctggaaaaga taaggcaata tctcttcact aaaaactaat tctaattttt cgcttgagaa
4141 cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc aaagccttta accaaaggat tcctgatttc
4201 cacagttctc gtcatcagct ctctggttgc tttagctaat acaccataag cattttccct
4261 actgatgttc atcatctgag cgtattggtt ataagtgaac gataccgtcc gttctttcct
4321 tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag cataaaatta gcttggtttc
4381 atgctccgtt aagtcatagc gactaatcgc tagttcattt gctttgaaaa caactaattc
4441 agacatacat ctcaattggt ctaggtgatt ttaatcacta taccaattga gatgggctag
4501 tcaatgataa ttactagtcc ttttcctttg agttgtgggt atctgtaaat tctgctagac
4561 ctttgctgga aaacttgtaa attctgctag accctctgta aattccgcta gacctttgtg
4621 tgtttttttt gtttatattc aagtggttat aatttataga ataaagaaag aataaaaaaa
4681 gataaaaaga atagatccca gccctgtgta taactcacta ctttagtcag ttccgcagta
4741 ttacaaaagg atgtcgcaaa cgctgtttgc tcctctacaa aacagacctt aaaaccctaa
4801 aggcttaagt agcaccctcg caagctcggt tgcggccgca atcgggcaaa tcgctgaata
4861 ttccttttgt ctccgaccat caggcacctg agtcgctgtc tttttcgtga cattcagttc
4921 gctgcgctca cggctctggc agtgaatggg ggtaaatggc actacaggcg ccttttatgg
4981 attcatgcaa ggaaactacc cataatacaa gaaaagcccg tcacgggctt ctcagggcgt
5041 tttatggcgg gtctgctatg tggtgctatc tgactttttg ctgttcagca gttcctgccc
5101 tctgattttc cagtctgacc acttcggatt atcccgtgac aggtcattca gactggctaa
5161 tgcacccagt aaggcagcgg tatcatcaac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc
5221 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa
5281 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta
5341 ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt
5401 tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag
5461 tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca
5521 gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc
5581 tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt
5641 tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag
5701 ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt
5761 tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat
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6241 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc
6301 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctg
//
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
| P0207/pG5Luc哺乳双杂交质粒 |
| P1316/pFN10A (ACT)哺乳双杂交质粒 |
| P1255/pFN11A(BIND)哺乳双杂交质粒 |
| P0176/pSV-Beta-Gal乳糖苷酶质粒 |
| P1208/pCMVbeta乳糖苷酶质粒 |
| P1237/pDRIVE-hbAct乳糖苷酶质粒 |
| P0722/pcDNA3.1-Laconic乳酸传感质粒 |
| P0132/pEGFP-1哺乳启动子检测质粒 |
| P1993/pDsRed2-1哺乳启动子检测质粒 |
| P0137/pAcGFP1-1哺乳启动子检测质粒 |
| P0977/pSuper-puro哺乳干扰质粒 |
| P4203/pSuper-GFP-NEO哺乳干扰质粒 |
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文献和实验相关实验
【求助】质粒有两个复制起始点，怎么复制呢？（red重组，pKD46质粒）
mnidr 我现在在做基因敲除，用的是red重组系统，pKD46质粒上携带有敲除所需的蛋白。pKD46质粒上有两个复制起始点Origin of Replication：repA101ts & oriR101 ；repA101ts是温度敏感型复制起始点。 有几个问题请教： 1.大家有用过这个pKD46的吗？oriR101是温度敏感型复制子还是条件诱导型复制子啊，我在网上查到它是温度敏感型复制起始点，我很不理解，为什么已经有一个温度
敲除系统，氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因并在卡那霉素抗性基因两边带有 FRT 位点，为重组转化提供筛选标志 pKD13 基因敲除质粒 Kan 序列：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AY048744.1 pKD46 基因敲除质粒 Chl 主要用于原核生物的基因敲除，Red
min。注：平末端连接效率较低，在连接体系中添加 PEG4000 可以提高连接效率。在连接体系中添加 EcoRV 酶可以显著提高阳性率。四、 转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 PCR 鉴定阳性克隆挑选阳性克隆进行测序验证, 验证正确后, 提取质粒进行转染试验, 关于 sgRNA 是否有效。可以转染之后，直接提取 DNA，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是 sgRNA 有效，如果没有则该 sgRNA 无效。
pKD46大肠敲除质粒
￥100 - 1000
