GluR4 mRNA原位杂交试剂盒

特别提示：包括GluR4 mRNA原位杂交试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：GluR4 mRNA原位杂交试剂盒
英文名称：GluR4 mRNA in situ hybridization kit

产品货号：GluR4 mRNA原位杂交试剂盒
产品规格：100T

基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：human,rat,mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.GluR4 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗Digoxin 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲*50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗Digoxin：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲*/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
GluR4的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

除了GluR4 mRNA原位杂交试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：5′RACE试剂盒
货号：BTN101105
规格：10次
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是5′-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其5′-端序列。本试剂盒就是根据5′-RACE原理而开发。RACE的原理如下图：


产品特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2.反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。

试剂盒组成：

成分	规格
MMLV逆转录酶-RI混合液(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	60μl
微量核酸沉淀剂	400μl
TdT(末端转移酶)	10μl
2×TdT Buffer(含dATP)	100μl
PCR MagicMix 3.0	1.5ml
5′-RACE引物A-引物B混合液	100μl
5′-RACE引物C	100μl
RNase-Free水	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

1.变性模板RNA：将1μg mRNA或5μg总RNA加入到一个RNase-free的PCR管中，补RNase-Free水到9μL，65℃保温5分钟后短暂离心，立即放冰上待用。如果RNA浓度偏低，体积超过9μl,可以使用本公司的核酸浓缩剂(需另购,产品编号为BTN110801)浓缩到所需的体积。
2. 设置RT反应(用户可以根据需要设阴性对照)：在上步的含变性后的RNA模板的PCR管中，按顺序加入：

成分	用量
自备的基因专一性引物A(10μM)	4μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	6μl
MMLV逆转录酶-RI混合液	1μl
合计	20μl

3. 37℃保温60分钟，42℃保温30分钟，50℃保温10分钟，最后75℃保温10分钟使逆转录酶变性。
4. 短暂离心5秒后待用。
5.在PCR管中加入40μl微量核酸沉淀剂(本产品含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分摇匀再取用)，震荡混匀。
6.室温12000rpm离心15分钟，小心吸弃上清。
7. 加入1mL自备75%乙醇，室温12000rpm离心5分钟，小心吸弃上清。
8. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，稍微晾干后加入10μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：为保证加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水最好不要超过10μl。
9. 加尾反应：在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer(含dATP)和1μL TdT酶，轻柔吹打混匀。
10. 37℃保温15分钟进行加尾反应，然后75℃保温3分钟灭活末端转移酶。
11. 加入0.5mL RNase-free水稀释加尾反应体系。此稀释液将作为PCR的模板。
12. 第一轮PCR：用不同量的稀释后的加尾反应液设置PCR反应(样品组最好设用量梯度，单位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
PCR MagicMix 3.0	25	25	25	25
自备基因专一性引物B(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
5′RACE引物 A-引物B混合液	2.5	2.5	2.5	2.5
稀释后的加尾反应液	1	5	10	15
RNase-free 水	19	15	10	5
合计	50	50	50	50

13. 按下列条件进行 PCR(注：应根据实际情况选择适当的退火温度)。
 第1次循环：94℃ 5分，48-52℃ 2分，72℃ 4分
 第2-30次循环：94℃ 40秒，52-60℃ 1分，72℃ 3分
 最后延伸：72℃ 15分
14. 取10-20μL PCR产物进行琼脂糖电泳电泳检查PCR结果，如果一条清晰的条带，则可以不做后续的第二轮PCR，而直接进行 DNA 测序或TA克隆。
15. 第二轮PCR：如果第一轮PCR没有一条清晰的条，则带从4管PCR产物中各取1μL分别加入到20μL RNase-free水中进行稀释，然后各取1μL分别作为4管第二轮PCR的模板：

成分	用量
第一轮 PCR产物的稀释液	1μl
PCR MagicMix 3.0	25μl
5′RACE引物 C	2.5μl
自备基因专一性引物 C(10μm)	2.5μl
RNase-free 水	补水至50μl
合计	50μl

16. 按下列条件进行 PCR：第 1-30次循环(94℃ 40秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3分)，最后延伸：72℃ 15分
17. 取10-20μL第二轮 PCR产物进行琼脂糖电泳，一般都会有一个样品有清晰的条带出现，则可以直接进行DNA测序或TA克隆。