RAC1 mRNA原位杂交试剂盒

特别提示：包括RAC1 mRNA原位杂交试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：RAC1 mRNA原位杂交试剂盒
英文名称：RAC1 mRNA in situ hybridization kit
产品货号：ZN1203
产品规格：100T

基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.RAC1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地*辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲*50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地*辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二*苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚jiǎ醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
RAC1的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

除了RAC1 mRNA原位杂交试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：AFLP试剂盒(EcoRI-MseI)
货号：BTN100903
规格：1600次
本产品在传统AFLP-PCR的基础上经过精心优化而开发。AFLP(amplified fragment length polymorphism)原理是一种结合RFLP和PCR技术特点的、迄今为止zuì有效分子标记分型技术，其原理如下：


产品特点：
1．一站式，足够50次酶切-连接反应、50次预扩反应和1600次AFLP PCR(PCR按30μL体系计算)，但不包括DNA 纯化和带型分析试剂(如PAGE电泳试剂和银染试剂)。
2．本系列产品提供EcoRI-MseI 组合，适用于GC含量在50%以上的基因组。对GC含量在50%以下的基因组，需从本公司采购AFLP(EcoRI-TaqI)组合。
3．各种参数都经过优化，一次PCR所得AFLP片段数一般在10-100之间，可重复性好，误差小于0.6%。
4．本产品适用于基因组在500 Mb-6000Mb的材料(如动物和植物)，对于基因组在50-500Mb的材料(如细菌和真菌)或50Mb以下的材料(如质粒，cosmid，BAC，YAC和PAC等)，需要分别另购专门的+1型预扩引物混合液和+3型EcoRI引物(8 种)AFLP引物对。

试剂盒组成：

成分	规格
酶切-连接Buffer，10×	100μl
EcoRI-MseI酶混合液	100μl
EcoRI-MseI 接头混合物	1ml
T4 DNA连接酶(1U/μL)	50μl
+0型预扩引物混合液	750μl
PCR Mix 3.0	9ml×3
对照DNA(50ng/μL)	20μl
+2型EcoRI引物(8条)	1ml每种
+3型MseI引物(8条)	1ml每种
TE溶液，pH8.0	10ml
超纯水	10ml
说明书	1份

+2型EcoRI引物和+3型MseI引物zuì后碱基的序列

引物名称	8条引物3′zuì后碱基
+2型EcoRI引物	-AA,-AT,-AG,-AC,-TA,-TT,-TG,-TC
+3型MseI引物	-CAA,-CAC,-CAG,-CAT,-CTA,-CTC,-CTG,-CTT

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：Southern级DNA纯化试剂，尿素-PAGE电泳套装，银染试剂盒。

使用方法：

一、DNA提取(本试剂盒不提供相关试剂)
用户需要自备50-500ng Southern级别的基因组DNA，用前zuì好预实验以确保DNA能够被EcoRI和MseI内切酶彻底切开。

二、限制性酶切和接头连接反应(本试剂盒足够50次本反应)
1．在0.2mL离心管中加入设置20μL的限制性内切酶酶切体系：

成分	用量
酶切-连接Buffer，10×	2μl
样品DNA	50ng(对小基因组材料) 500ng(对大基因组材料) 如果用对照，则用5μL
EcoR I-Mse I酶混合液	2μl
超纯水	加水到20μl

2．轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温2小时酶切(若PCR 仪器不带热盖，则必须加50μL自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同)，70℃保温15分钟灭活内切酶。
3．在上述酶反应体系中加入20μl EcoRI-MseI 接头混合物和1μl T4 DNA连接酶，轻柔混匀并短暂离心后，20℃保温2小时让接头跟DNA片段相连。
4．在一个离心管中加入10μl上步得到的连接反应液和90μL TE缓冲液，pH8，充分混匀，得到酶切-连接反应10倍稀释液，未用完的酶切-连接反应原液(30μL)可放-20℃保存。

三、预扩增(本试剂盒足够50次本反应)
5．在0.2mL离心管中设置30μl的PCR 体系：

成分	体积
酶切-连接反应液10倍稀释液	5μl
+0型预扩引物混合液	10μl
PCR Mix 3.0	15μl

6．离心数秒，按下列参数进行PCR预扩增：

	温度	时间
PCR(20次)	94℃	30s
	56℃	60s
	72℃	60s

7．可以取10μl PCR产物在1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物为100-1500bp 模糊条带。
8．将剩下的预扩反应液用TE 稀释50倍，直接用于下步反应或放-20℃保存待用。

四、选择性PCR扩增(本试剂盒足够至少1600次本反应)
9．在0.2mL PCR 管中，加入下列成分(如果用户已经知道哪个一种或几种引物组合适合自己的材料，则直接使用；如果不知道，则需要预先测试所有64 种组合，设置64个PCR反应)，下面只是一种组合：

成分	体积
预扩反应液50倍稀释液	5μl
+2型EcoR I引物之一(八种之一)	5μl
+3型Mse I引物之一(八种之一)	5μl
PCR Mix 3.0	15μl

10．轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行PCR：

	温度	时间
PCR(13次)	94℃	30s
	65℃	30s(每次循环递减0.7℃)
	72℃	60s
PCR(13次)	94℃	30s
	55℃	30s
	72℃	60s
延伸	72℃	5min

五、尿素-PAGE电泳和银染(需另购试剂并按相关说明书进行)