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- 百奥莱博
- BTN101105-TUL
- 北京
- 2025年07月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
292
- 英文名：
5′-RACE Kit
- 保质期：
一年
- 供应商：
北京百奥莱博科技有限公司
- 保存条件：
低温运输、-20℃
- 规格：
10次
特别提示：包括5′RACE试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
产品名称：5′RACE试剂盒
英文名称：5′-RACE Kit
产品货号：5′RACE试剂盒
产品规格：10次
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是5′-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其5′-端序列。本试剂盒就是根据5′-RACE原理而开发。RACE的原理如下图：
产品特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2.反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。
试剂盒组成：
| 成分 | 规格 |
| MMLV逆转录酶-RI混合液(RNase H-，200U/μL) | 10μl |
| MMLV Buffer-dNTP混合液 | 60μl |
| 微量核酸沉淀剂 | 400μl |
| TdT(末端转移酶) | 10μl |
| 2×TdT Buffer(含dATP) | 100μl |
| PCR MagicMix 3.0 | 1.5ml |
| 5′-RACE引物A-引物B混合液 | 100μl |
| 5′-RACE引物C | 100μl |
| RNase-Free水 | 1ml |
储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。
使用方法：
1.变性模板RNA：将1μg mRNA或5μg总RNA加入到一个RNase-free的PCR管中，补RNase-Free水到9μL，65℃保温5分钟后短暂离心，立即放冰上待用。如果RNA浓度偏低，体积超过9μl,可以使用本公司的核酸浓缩剂(需另购,产品编号为BTN110801)浓缩到所需的体积。
2. 设置RT反应(用户可以根据需要设阴性对照)：在上步的含变性后的RNA模板的PCR管中，按顺序加入：
| 成分 | 用量 |
| 自备的基因专一性引物A(10μM) | 4μl |
| MMLV Buffer-dNTP混合液 | 6μl |
| MMLV逆转录酶-RI混合液 | 1μl |
| 合计 | 20μl |
3. 37℃保温60分钟，42℃保温30分钟，50℃保温10分钟，最后75℃保温10分钟使逆转录酶变性。
4. 短暂离心5秒后待用。
5.在PCR管中加入40μl微量核酸沉淀剂(本产品含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分摇匀再取用)，震荡混匀。
6.室温12000rpm离心15分钟，小心吸弃上清。
7. 加入1mL自备75%乙醇，室温12000rpm离心5分钟，小心吸弃上清。
8. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，稍微晾干后加入10μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：为保证加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水最好不要超过10μl。
9. 加尾反应：在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer(含dATP)和1μL TdT酶，轻柔吹打混匀。
10. 37℃保温15分钟进行加尾反应，然后75℃保温3分钟灭活末端转移酶。
11. 加入0.5mL RNase-free水稀释加尾反应体系。此稀释液将作为PCR的模板。
12. 第一轮PCR：用不同量的稀释后的加尾反应液设置PCR反应(样品组最好设用量梯度，单位：μL)。
| 成分 | 梯度1 | 梯度2 | 梯度3 | 梯度4 |
| PCR MagicMix 3.0 | 25 | 25 | 25 | 25 |
| 自备基因专一性引物B(10μM) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 5′RACE引物 A-引物B混合液 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 稀释后的加尾反应液 | 1 | 5 | 10 | 15 |
| RNase-free 水 | 19 | 15 | 10 | 5 |
| 合计 | 50 | 50 | 50 | 50 |
13. 按下列条件进行 PCR(注：应根据实际情况选择适当的退火温度)。
第1次循环：94℃ 5分，48-52℃ 2分，72℃ 4分
第2-30次循环：94℃ 40秒，52-60℃ 1分，72℃ 3分
最后延伸：72℃ 15分
14. 取10-20μL PCR产物进行琼脂糖电泳电泳检查PCR结果，如果一条清晰的条带，则可以不做后续的第二轮PCR，而直接进行 DNA 测序或TA克隆。
15. 第二轮PCR：如果第一轮PCR没有一条清晰的条，则带从4管PCR产物中各取1μL分别加入到20μL RNase-free水中进行稀释，然后各取1μL分别作为4管第二轮PCR的模板：
| 成分 | 用量 |
| 第一轮 PCR产物的稀释液 | 1μl |
| PCR MagicMix 3.0 | 25μl |
| 5′RACE引物 C | 2.5μl |
| 自备基因专一性引物 C(10μm) | 2.5μl |
| RNase-free 水 | 补水至50μl |
| 合计 | 50μl |
16. 按下列条件进行 PCR：第 1-30次循环(94℃ 40秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3分)，最后延伸：72℃ 15分
17. 取10-20μL第二轮 PCR产物进行琼脂糖电泳，一般都会有一个样品有清晰的条带出现，则可以直接进行DNA测序或TA克隆。
除了5′RACE试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：
| 货号 | 名称 | 规格 |
| ZN0057 | Androgenbinding protein/ABP mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0286 | Chr-A mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0377 | Daniorerionfe212b mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0519 | Fig4 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0693 | HTR2A mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0725 | IL17 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0750 | Integrin-α3/ITGA3 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0839 | LDL-R mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0852 | LPRP mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0914 | MMP-7 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN0941 | N-ras mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN1035 | OB-Rb mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN1305 | SPAR C mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN1348 | Synaptotagmin3 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
| ZN1407 | TLR8 mRNA原位杂交试剂盒 | 100T |
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文献和实验请哪位大侠帮我解决一下5'RACE引物的设计问题（TAKARA试剂盒）
大侠，你好，我是一位涉世不深者，用TAKARA公司的3'RACE试剂盒刚克隆完3'RACE的序列，大概1000bp，现在想同样用5'RACE的试剂盒把5'末端做出来，但是因为TAKARA的试剂盒要设计5条引物，一条反转录引物，两对PCR引物，我觉得有点难，请哪位大侠告诉我设计这几条引物应该注意什么，该如何设计，我把序列也贴出来，希望哪位大侠帮帮忙，有时间帮我分析一下这段序列，当然如果帮我设计这5条引物来，小生真是不甚
MgCl2，dNTP每个200 µM，引物每个400 nM ]进行扩增，其中分别是AAP和引物TSC－2－2826（A带）或引物TSC－2－1732（B带）一起使用。 优化5′RACE的TdT加尾条件 发现有几个因素影响cDNA 3′末端加尾效率：1）RNA的存在抑制TdT；2）缓冲液成分和反应条件；3）TdT的数量和纯度；和4）cDNA 3′末端的二级结构。 虽然TdT不能用RNA作为底物，但RNA的存在能够抑制酶活性，在添加0.01mg这么少的RNA，就能够导致加尾寡聚核苷酸数量较少和加上的核苷
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