7)内源性污染
a. 对于外植体:以1cm(或更短)外植体为例,添加4~5% PPM到完全MS基础盐中,但千万不要添加Tween 20和 pH调整剂,搅拌4~12小时之后直接拿出。不用清洗,直接插入含有PPM的培养基里,若是草本植物换至0.05~0.1%PPM的萌发培养基即可;而木本植物则换至0.2% PPM的萌发培养基。
注意:以下从第7段(b)到10用于观赏植物。
b. 对于块茎,球茎和鳞状物:把整个块茎/球茎/鳞状物在漂白剂里摇或搅拌。然后用水冲洗(可以在非无菌条件下操作)。把块茎/球茎切成小片,在含有4-5%PPM的全基盐中摇或搅拌12-24 h,不要加pH调整剂和Tween 20。不用冲洗直接插入到含有0.1-0.2% PPM的培养基中。
8)如果按照以上操作流程没有取得满意的结果(尤其是厚的和非常密集的外植体、种子),我们建议按照以下流程:
a. 在水中摇或搅拌外植体(较软的组织1h,较坚硬的组织2h);
b. 在含有50% PPM的完全MS基础盐中(不加pH调整剂和Tween 20)摇或搅拌5-10 min。
c. 无需冲洗,直接把处植体插入到培养基中。如果真菌污染,可以选择额外再加入PPM到培养基中。
然而,对于细菌或混合污染,第一个月在培养基中加入0.05-0.2%的PPM是必要的。不要丢弃高度氧化的外植体,因为大约50%的外植体在4-6周内即可恢复正常。
9)为了消除“组培中”污染的植物材料(抢救措施):
注意:仅适合明显观察到受污染不超过一周的组织。
a. 在自来水细水流下面用牙刷清洗材料。在含有50% PPM(用灭菌水稀释)中摇或搅拌5-15 min。对于细菌或混合污染,我们建议用低pH值2.8-3.2的溶液,即100% PPM与0.6g/L的柠檬酸溶液(用灭菌水)按1:1混合。
b. 不用冲洗直接把处理好的材料插入到含有0.05-0.2% PPM的培养基里,培养至少一个月。前10天弱光培养,如上所提,不要丢弃高度氧化的外植体,等4-6周以后将约有50%的材料恢复。
对于真菌孢子或细菌位于外植体极深的部位,而PPM无法接触到的情况,需要把材料在水中浸泡一段时间,然后沿着外植体切片,在50% PPM中摇或搅拌5-15 min。通过以上消毒步骤,保证PPM能够充分接触到外植体的整个表面。