无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒

特别提示：包括无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒
英文名称：Endotoxin-free plasmid DNA large-scale extraction kit
产品规格：5次

本试剂盒是整合大提质粒DNA提取试剂盒和菌体内毒素清除剂两产品而成。菌体内毒素清除剂是我司独家推出的产品，在质粒提取前就把细胞壁上的内毒素清除掉，彻底避免了目前通用的先提取DNA+内毒素混合物，再从中纯化质粒DNA的弊端。用本产品提取的质粒DNA，内毒素的污染浓度低，适合于转染等对内毒素的污染敏感的实验。

试剂盒特点：
1. 操作简单，只在经典的柱式质粒DNA提取前，增加菌体内毒素清除一步。
2. 去内毒素效果好，处理一次可以去除99%以上的内毒素。
3.质粒丢失少，产率只比柱式质粒DNA提取试剂盒低5-10%，效果好于先提质粒DNA，再用液相内毒素清除剂处理的方法。
4. DNA可以直接用于转染等实验。

试剂盒组成：

成分	规格
菌体内毒素清除剂	200ml
溶液A	25ml
溶液B	25ml
溶液C	35ml
RNase A溶液(10mg/mL)	300μl
吸附柱活化液	12.5ml
大提离心吸附柱	5套
通用洗柱液	100ml
DNA洗脱液3.0	10ml
说明书	1份

储存条件：RNase A溶液需4℃或-20℃保存，其余成分可室温保存，如有沉淀可加热溶解后再使用。

使用方法：
1. 用50mL塑料离心管收集不超过40mL的E.coli 饱和菌液，5000rpm离心5-10分钟，弃上清，得到细菌沉淀。
2. 加入10mL菌体内毒素清除剂，温和混匀后5000rpm离心5-10分钟，弃上清(含内毒素)。
3. 重复上述操作3次，得到的菌体将丢失了绝大部分细胞表面的内毒素。
4. 往细菌沉淀中加入5mL溶液A(第一次使用时需要将RNase A溶液全部加入并混合均匀，未用完的部分放4℃保存)，充分振荡悬浮。注意：充分重悬细胞沉淀(无块状物)对于获得高的质粒产量十分重要。
5. 加5mL溶液B，温和翻转10 余次至透明。若混合液不透明，应减少细菌的用量或室温放臵5-10分钟直到裂解液变透明。注意: 避免剧烈振荡，否则细菌基因组DNA 将断裂为小片段，与质粒难以分离，污染质粒DNA。
6. 加入冰浴的7mL溶液C，颠倒混匀，冰上放臵10分钟。混合物中将有白色絮状物形成。注意不要过分振荡。
7.在等待期间，活化离心吸附柱。在离心吸附柱中加入2.5mL活化液，套上收集管后室温放臵2分钟，然后5000rpm离心2分钟，倒弃穿透液，再将吸附柱套上收集管后待用。活化后的离心吸附柱必须立即使用。如果不活化，质粒得率将低20-40%左右。
8. 6000rpm离心10分钟。如果离心管承受能力强，离心速度还可以适当提高以充分沉淀絮状物。
9. 将上步得到的上清液移入到大提离心吸附柱中，放入50mL收集管中。室温放臵5分钟左右以便让质粒DNA跟膜结合。
10. 6000rpm离心5分钟，质粒DNA 将与大提离心吸附柱中的膜结合。弃穿透液。
11. 将10mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，室温静臵2分钟后6000rpm离心5分钟，弃穿透液。
12. 重复上步一次。
13.室温6000rpm 空甩5分钟，弃穿透液。注意：此步很重要，不能跳过，否则残留乙醇会影响后续实验。
14. 将大提离心吸附柱放入一个干净的50mL塑料离心管中，加0.5mL DNA洗脱液3.0(洗脱液如加热到50-65℃效果更佳)，室温静臵2分钟后6000rpm离心5分钟，收集液即是质粒DNA溶液。
15. 重复上步3-4次可洗脱更多的质粒DNA。DNA 洗脱液3.0 不够可以用TE或超纯水替代。
16. 合并所得质粒DNA，立即使用或-20℃储存。

注意事项：
1．细菌培养时间一般为12-16小时，但接种量大时应减少时间。过度培养会降低质粒的质量甚至导致质粒DNA突变。
2．注意溶液A：溶液B：溶液C的比例为5：5：7。若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量。
3．随菌体增多应延长溶液B的作用时间，直至溶液成粘稠透明状。但时间过长会导致质粒DNA变性。
4．加溶液C后形成的白色沉淀中有变性的蛋白质、细菌基因组DNA和细胞碎片，离心后应避免带入到后续处理中。
5．通用洗柱液洗涤离心柱后必须甩干一次，否则残留通用洗柱液中的乙醇会干扰后续实验。
6．质粒的具体产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。一般1.5mL 过夜培养菌体可收获约10μg高拷贝质粒。
7．纯化的质粒在电泳中表现为2-3 条带有时甚至为4-6 条带均属正常，未分开的环套质粒，易被误判为基因组DNA。