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- 百奥莱博
- KFS303-LWU
- 北京
- 2025年07月14日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
387
- 英文名：
Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit
- 保质期：
长期
- 供应商：
北京百奥莱博科技有限公司
- 保存条件：
的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于RT
- 规格：
100T
萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物萤(bioluminescence)。海肾萤光素酶是一种分子量约为36kD的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的过程中也会发出生物萤光。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定。
萤火虫萤光素酶催化luciferin发光的最强发光波长为560nm。海肾萤光素酶催化coelenterazine发光的最强发光波长为465nm。
通常将目的基因的5′UTR或者启动子克隆至Firefly Luciferase的上游，或者3′UTR克隆至Firefly Luciferase的下游，通过检测萤火虫荧光素酶的量来检测启动子或者调控元件的转录调控作用。Renilla Luciferase作为内参，来消除细胞数量或者转染效率的差异。
试剂盒组成：
| 组分 | 规格 |
| 细胞裂解液 | 5mL |
| 萤火虫荧光素酶检测缓冲液 | 10mL |
| 100×萤火虫荧光素酶检测底物 | 100μL |
| 50×Renilla荧光素酶检测底物 | 200μL |
| Renilla荧光素酶检测缓冲液 | 10mL |
注意：
- 细胞裂解液在96孔板中裂解，可以用200次以上。
- 细胞裂解液、萤火虫荧光素酶检测缓冲液、Renilla荧光素酶检测缓冲液在4℃可以保存一个月，-20℃可以保存一年，-70℃可以长期保存；萤火虫荧光素酶检测底物和Renilla荧光素酶检测底物在20℃可以保存六个月，在-70℃可以保存一年。
操作方法：
萤火虫荧光素酶检测缓冲液临用前加入100×萤火虫荧光素酶检测底物，标记为萤火虫荧光素酶检测试剂；Renilla荧光素酶检测缓冲液临用前加入50×Renilla荧光素酶检测底物，标记为Renilla荧光素酶检测试剂。此检测工作液需现配现用。
- 裂解细胞
根据不同的细胞培养板加入适量的细胞裂解液多孔板 裂解液 6孔板 500μL 12孔板 250μL 24孔板 100μL 48孔板 65μL 96孔板 20μL - 对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后用1×PBS润洗2遍后加入细胞裂解液，使裂解液完全覆盖细胞。
- 对于悬浮细胞：离心去上清后用1×PBS润洗2遍后离心去上清，加入细胞裂解液。
- 于振荡器上室温裂解20min以裂解充分。
注：细胞裂解后可以立即测定荧光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。 - 荧光数值检测（酶标板中操作）
将样本、萤火虫荧光素酶检测试剂、Renilla荧光素酶检测试剂平衡至室温后再进行以下操作：- 取20μL细胞裂解样本，加至黑色酶标板中，按照实验要求，可设置3～5孔重复。
- 每孔加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，用移液器轻柔吹打混匀后OD560nm处读数；以不含细胞的细胞裂解液为空白对照，检测尽量在30min内完成。
- 每孔加入100μL Renilla荧光素酶检测试剂，使用酶标仪震荡混匀后OD465nm处读数。以不含细胞的细胞裂解液为空白对照，检测尽量在30min内完成。
- 计算荧光比值
在以Renilla荧光素酶为内参的情况下，用萤火虫荧光素酶测定得到的RLU（relative light unit）值除以Renilla荧光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。
注意事项：
- 无菌操作。
- 荧光染料操作中注意避光进行。
- 由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达到室温后再进行测定。
- 为保证荧光素酶检测试剂的稳定性，可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。
- 萤火虫荧光素酶检测试剂、Renilla荧光素酶检测试剂最好现用现配。
- 细胞裂解液及裂解时间可根据细胞量适当增加、延长。
- 关于检测仪器的选择：能够检测化学发光或者生物发光的仪器都可适用于此试剂盒。如果使用多功能酶标仪，为防止各孔之间的干扰，我们推荐使用黑色酶标板，并且不同实验组之间最好有间隔。
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文献和实验在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因（比如CAT，β-Gal，GUS）不够便利。因为各自的测试化学，处理要求，检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术，结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统，结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速，灵敏，简便。系统还提供PLB裂解液，用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞，不需操作单个样品
【求助】请教一个关于双荧光素酶报告基因检测系统中共转染两种报告基因质粒的比例的问题？
lsdcfhyj 用双荧光素酶报告基因检测系统进行报告基因检测时需要共转染两种荧光素酶报告基因质粒，但是我不知道两种质粒间的比例是多少，有哪位前辈做过这方面实验的，请帮我指点一下，谢谢了 xxshc 这个比例没有特别的规定。我用的pRL－TK（海蜃素荧光素酶）的荧光值要高一些，我转20ng/孔（24孔板），作为内参.pGL3（萤火虫荧光素酶）的荧光值低一些，我转0.4ug/孔（24孔板）然后0.4ug的调整质粒。这样的话，萤火虫荧光素酶
1、双荧光素酶实验原理； 2、验证转录因子与启动子互作； 3、验证miRNA与mRNA互作
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