高纯质粒中提试剂盒

特别提示：包括高纯质粒中提试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：高纯质粒中提试剂盒
英文名称：PlaPure Midi Extraction Kit

产品货号：高纯质粒中提试剂盒
产品规格：50次

  本试剂盒提供一种简单、快捷、高效的提取质粒的方法，在碱裂解法裂解细胞的基础上，采用独特的硅基质膜吸附技术和试剂配方，通过离心吸附柱在高盐状态下高效专一的结合溶液中的质粒DNA，经过两步洗涤，一步洗脱，最大限度的去除蛋白质、基因组、RNA和其他杂质。得到的质粒DNA可直接用于细胞转染、PCR、酶切、测序、连接等生物学实验。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer P1	30ml
Buffer P2	30ml
Buffer N3	40ml
Buffer PB	10ml
Buffer PW(浓缩液)	10ml
Buffer EB	10ml
RNase A(10 mg/ml)	600μl
吸附柱DL及收集管	50套

自备试剂：无水乙醇。

实验前准备及重要注意事项：
1、所有组分可在干燥、室温(15～30℃)环境稳定保存1年，更长时间保存可置于2～8℃，加入RNase A的Buffer P1 置于2～8℃可稳定保存6个月。
2、第一次使用前，将RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混匀，置于2–8℃保存，使用前需在室温中放置一段时间，恢复至室温后使用。
3、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW中加入无水乙醇。
4、使用前若发现Buffer P2、Buffer N3、Buffer PB有沉淀，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清(请勿剧烈晃动Buffer P2)。
5、注意不要直接接触Buffer P2 和Buffer N3，使用后应立即盖紧盖子。
6、提取质粒的量和纯度与细菌培养浓度、菌株种类、质粒大小、质粒拷贝数等因素有关。
7、所有离心步骤均可在室温下进行。

操作步骤：
1、取5-15ml过夜培养的菌液加入离心管(自备)中，13000rpm(~～～16200×g)离心1分钟收集菌体沉淀，尽量吸弃上清。
注意：质粒拷贝数较低或>10 kb时，可以使用更多菌液通过二次离心将菌体沉淀收集到同一个离心管中，同时后续所加试剂Buffer P1、P2及N3的量需加倍。所加试剂的量必须能够充分裂解菌体，菌体过多、裂解不充分都会降低质粒的提取效率。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入500μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室温放置3-5分钟。此时溶液应变得清亮粘稠。。
注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。并且此步骤所用时间应不超过5分钟，避免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入700μl Buffer N3，立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。13000rpm离心10分钟。
注意：Buffer N3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。
5、将步骤4中所得的上清液转移到已装入收集管的吸附柱DL中，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：吸附柱的最大容积为750μl，如果样品体积大于750μl可分批加入。
6、向吸附柱中加入150μl Buffer PB，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入750μl Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
8、将吸附柱重新放回收集管中，13000rpm离心1分钟。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
9、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附膜中间部位加入100-200μl Buffer EB，室温放置2-5分钟，13000rpm离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒。
注意：
1)为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，13000rpm离心2分钟。将质粒溶液收集到离心管中。
2)洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。
3)质粒拷贝数较低或>10 kb时，Buffer EB在65-70℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。

储存条件：室温(15～30℃)

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货号	名称	规格
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