高纯度质粒提取试剂盒

特别提示：包括高纯度质粒提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：高纯度质粒提取试剂盒
英文名称：High purity Plasmid Extraction Kit

产品货号：高纯度质粒提取试剂盒
产品规格：100次|200次

本试剂盒采用经典的碱裂解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合DNA的特性，可以从1–5ml大肠杆菌LB培养液中快速提取3–20μg纯净的高拷贝质粒DNA。提取的质粒可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等实验。然而，对质粒纯度要求更高的转染实验(要求无内毒素)，此试剂盒不能达到要求。另外，尽管该试剂盒可以抽提较大的质粒(>10kb)，但我们不推荐使用。如果一定要使用，请参考以下方法：加大菌体使用量(使用5–10 ml过夜培养物)，同时按照比例增加P1、P2、P3的用量；洗脱缓冲液应在70℃预热，在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率，其它步骤相同。

本试剂盒使用了有颜裂解液，菌体裂解是否完全一目了然。由于判断菌体裂解和中和是否彻底更主要取决于操作者的经验，所以我们增加了有颜裂解液(一种能使裂解/中和体系变换颜色的试剂)来帮助观察裂解/中和的程度。加入P1后，有颜裂解液使菌液变为浑浊的红色；加入P2后，有颜裂解液立即使溶液变为澄清的红色，裂解是否完全只要观察红色溶液是否澄清，如果红色非常均一，表明裂解充分；在完全裂解的体系中加入P3混匀后，体系立即变为黄色，任何红色的残留表明没有完全混匀或者中和不彻底。

本试剂盒增加了去蛋白液PD，能更加彻底地去除蛋白污染，得到纯度更高的质粒。

试剂盒组份：

试剂盒组成	100次	200次	贮存方式
RNase A	300μl	600μl	-20℃
有颜裂解液	600μl	2×600μl	室温
溶液P1	30 ml	60 ml	室温(加入RNase A后2-8℃保存)
溶液P2	30 ml	60 ml	室温
溶液P3	40 ml	80 ml	室温
去蛋白液PD	60 ml	120 ml	室温
漂洗液PW	25 ml	2×25 ml	室温
洗脱缓冲液EB	15 ml	15 ml	室温
质粒吸附柱CP	100个	2×100个	室温
收集管(2 ml)	100个	2×100个	室温
说明书	1份	1份

储存条件：室温，有效期12个月。

除了高纯度质粒提取试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：非冻型尿液DNA保存液
货号：BTN90315
规格：100mL
本品在室温条件下长期保存用于DNA提取的尿液样品保存液。它能够高效、长期保证DNA分子的完整性。

产品特点：
1. 保存时间长，可室温保存尿液DNA长达六个月，尤其适合于野外尿液样品采集。
2. DNA完整性好，纯化后长度在20-50 Kb之间。
3. DNA无化学修饰，提得的DNA可用于酶切、电泳、Southern杂交和PCR等分子生物学实验。
4. 能防止尿液在4℃结晶。
5. 安全可靠，本产品无毒无害。
6. 使用简单，直接把新鲜的尿液样品与本产品混合即可。

储存条件：室温运输及保存，有效期两年。

使用方法：(以DNA提取为例)
1. 迅速将尿液与本产品按10:1的比例混合。
2. 常温闭光保存直到使用。
3. 使用常规液体DNA提取方法提取DNA即可。推荐使用柱式尿液DNA提取试剂盒(BTN90314)，使用柱式尿液DNA提取试剂盒提取本产品保存的尿样，兼容性好，提取效率更高。
4. 提取得到DNA可用于酶切、电泳、Southern杂交和PCR等分子生物学实验。

名称：柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)
货号：BTN120501
规格：15次
本试剂盒就是基于先纯化动物细胞线粒体、再从中柱式法纯化其DNA的两步法试剂盒。

试剂盒特点：
1. 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2. 两步法，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，有粗提(mtDNA纯化前不用DNase处理线粒体)和精提(mtDNA纯化前用DNase处理线粒体)两套操作方案，适合于各种要求不同的后续实验。
3. 本产品一次可以处理约107×108个培养细胞，10mg培养细胞(相当于5瓶150 mm培养细胞)可以纯化到到0.2-0.5mg线粒体。
4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。
5. 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

试剂盒组成：

成分	规格	备注
溶液A	225ml	配制匀浆液
蔗糖	25.4g	配制匀浆液
詹纳斯染色液	1ml	染色线粒体
溶液B	0.5ml	配制核酸酶反应液
DNase A干粉	1mg	酶切细胞核DNA
Benzonase(1U/μL)	100μl	酶切细胞核DNA
溶液C	10ml	纯化mtDNA
溶液D	5ml	纯化mtDNA
溶液E	20ml	纯化mtDNA
离心吸附柱	15套	纯化mtDNA
通用洗柱液	15ml	纯化mtDNA
DNA洗脱液	10ml	纯化mtDNA
人TPMT VNTR	上游引物	GCT CCG CCC TGC CCA TTT
	下游引物	GCC TCC GCC ACC AAT GAC
人线粒体HV2区	上游引物	GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C
	下游引物	CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存，保存期限一年。

使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。

一：线粒体粗提
1. 称25.4g蔗糖到225mL溶液A中，盖上盖子后充分摇晃3～5分钟溶解即得250mL溶液A工作液，放冰上预冷待用。未用完的溶液A工作液需要-20℃保存，否则会长菌。
2. 如果是单层细胞，先用20mL PBS缓冲液洗涤107×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集107×108个细胞，再用20mL PBS缓冲液洗涤2次，最后将细胞重悬在20mL PBS缓冲液中。
3. 用平甩转子(swinging-bucket rotor)离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。
4. 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的溶液A工作液，轻柔重悬细胞。
5. 如果是成纤维细胞，由于其难于裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是，则直接进入下步操作。
6. 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中(工作体积为10-15mL，间隙为0.12 mm，最好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低)匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3μl匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20-50%以下为佳。
7. 用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
8.转移上清液到离心管中，冰上放置待用。如有必要，可在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴一滴上清液到载玻片上，再滴入50μl詹纳斯染液染色20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
9. 用固定角度转子(fixed-angle rotor)离心机4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
10. 用5mL溶液A工作液洗涤2次得线粒体粗提液(即重悬后，4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清)。
11. 如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第3部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。
12. 如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。

二：线粒体粗提液中细胞核DNA的去除及鉴定
13. 将线粒体重悬于0.3mL溶液A工作液中，取10μl作为未处理对照。
14. 加入6μl Benzonase(1U/μL)溶液和30μl DNase A溶液(配法：将0.5mL溶液B加到装有1mg DNase A干粉的离心管中得到2mg/mL溶液，未用完的部分需要分装后放-20℃保存)。
15. 37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：最好先预实验，每隔一段时间取10μl样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增1-4个自选的VNTR位点和1-2个mtDNA基因(如vis或COII基因)，检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为最佳。可从本公司另购细胞核基因和线粒体基因专一性引物。
16. 加入10μl自备的0.5M EDTA溶液(pH8.0)以终止酶反应。显微镜下检查线粒体完整性(见上节第8步)。
17. 用固定角度转子离心机4℃10000 g离心10分钟，弃上清。
18. 用1mL的溶液A工作液洗涤沉淀(即重悬后，4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清。此为一次洗涤。)2次得到线粒体沉淀。

三：线粒体DNA提取
19.在不超过100μl的线粒体沉淀中加入600μl预热的溶液C到沉淀中，充分吹打均匀。
20. 再加入150μl(可称150-160mg)预热的溶液D到离心管中，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。
21. 65℃放置3～5分钟。
22. 加入200μl自备氯*，震荡混匀10-30秒，此时溶液将呈乳白色。
23. 12000～15000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间的白膜。
24. 加入1.5倍体积的溶液E，颠倒混匀后全部转移到离心吸附柱中，室温放置至少2分钟。
25. 12000rpm室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。
26. 通用洗柱液洗涤2次(将0.5mL加入离心柱中，12000rpm室温离心1分钟，弃穿透液，此为洗涤一次，再重复一次)。
27. 空甩半分钟去除残留液体,将离心吸附柱转移到新的1.5mL离心管中。
28. 加30-50μl DNA 洗脱液，室温放置3～5分钟。
29. 12000rpm室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液。