即用型荧光定量PCR试剂盒

特别提示：包括即用型荧光定量PCR试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：即用型荧光定量PCR试剂盒
英文名称：Instant Fluorescent qPCR Kit

产品货号：即用型荧光定量PCR试剂盒
产品规格：1mL

本产品是基于荧光染料检测的即用型PCR试剂盒，可以对靶片段进行实时定量PCR分析。产品含有经过优化的缓冲液组分、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2及新型荧光染料DNAgreen等所有实时定量PCR所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行实时定量PCR反应和HRM分析，具有广泛的用途。

产品特点：
1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行实时定量PCR实验和HRM(High Resolution DNA Melt Curve Analysis)分析。而基于SYBR Green I和LC Green染料的qPCR mix则不能同时用于上述两种实验。
2. 使用第三代饱和型荧光染料，信号强，不会抑制PCR反应。
3.快捷，即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
4. 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能检测到浓度为50拷贝/mL的靶分子。

试剂盒组成：

成分	规格
Taq DNA聚合酶(5U/μL)	100μl
易错PCR Mix，10×	300μl
易错PCR专用dNTP，10×	300μl
MnCl2，5mM	300μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，保存期限为6个月。

使用方法：

1.以20μl的qPCR反应体系为例：在一干净的PCR管中，加入下列成分：

反应体系成分	20μl体系	终浓度
qPCR MagicMix，2×	10μl	1×
自备引物一	xμl	0.1-0.5μM
自备引物二	xμl	0.1-0.5μM
自备模板	xμl
自备ROX	2μl	(可以不加)
补超纯水到	20μl

放入荧光PCR仪中进行扩增，并在退火或延长步骤中记录荧光信号。
注意：
a)通常引物浓度以0.2μm可得到较好结果，可以终浓度0.1-1.0μm作为设定范围的参考；通常DNA模板的量以10-100 ng基因组DNA或1-10 ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
b)ROX 校正染料：如果使用ABI公司的7500，7700和7900三种型号的荧光PCR仪器，则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI 7700和7900，ROX的最佳浓度为1×(即在每20μl反应体系中加2μl 10×ROX)。对ABI 7500，ROX的最佳浓度为0.05-0.1×(每20μl反应体系加0.1-0.2μl 10×ROX；也可将10×ROX稀释到1×，然后每个反应体系加入1-2μl 1×ROX)。ROX会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数*(代"据")。
对于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000，RotorGene3000，RotorGene 6000和LightCycler 480等型号的荧光PCR仪器，ROX不是必须的，但加入的话也不会影响整个PCR分析。

2. 循环步骤：根据扩增子的性质和仪器性能，从以下三个过程中任选一个进行扩增。
两步快速循环法：适用于引物Tm值设计为60℃的反应

循环步骤	温度	时间	循环数
酶活化	95℃	10min	1
变性	95℃	15s	35-40
退火&延伸	60℃	1min

注意：本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。
三步快速循环法：适用于延伸步骤温度高于退火步骤的PCR(长引物PCR)

循环步骤	温度	时间	循环数
酶活化	95℃	10min	1
变性	95℃	10s	35-40
退火	56-64℃	30s
延伸	72℃	32s

注意：
·退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。若提高反应特异性，可提高退火温度，以60-64℃作为设定范围的参考。若因使用Tm值较低的引物等原 因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。
·延伸温度：延伸温度设为72℃通常可以提高扩增效率。但是，对于AT含量大于70%的扩增子来说，延伸温度设为60℃为宜。
通用循环法：这种循环方法适用于几乎所有的荧光PCR仪，也适用于用快速循环法不能扩增的模版。

循环步骤	温度	时间	循环数
酶活化	96℃	10min	1
变性	96℃	15s	35-40
退火&延伸	60℃	1min

3. 数*(代"据")采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合DNA时，最大吸收光谱在471nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500nm，最大发射光谱在530nm。

注意事项：
1. 如果使用iCycler，可以不加入FAM。
2. 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛细管进行PCR，需加入终浓度为0.5mg/mL的自备BSA。

除了即用型荧光定量PCR试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：5M甜菜碱溶液，PCR级
货号：BTN70902
规格：1.5mL
本产品为浓度为5M的甜菜碱的水溶液，可以直接加入到PCR反应或测序反应中提高扩增或测序的效率，其详细的用途包括：
1. 降低富含GC的模板形成二级结构的可能,有助于富含GC的模板的PCR扩增和测序。
2. 降低变性温度对碱基的依赖性。
3. 提高LA-PCR的扩增效率。
4. 提高Taq DNA聚合酶的稳定性。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：将本产品加入PCR反应体系中，使其终浓度在1.0-1.7M之间即可。其他按常规操作进行即可。


名称：cDNA第一链合成试剂盒II(RNase H-)
货号：YT397
规格：20次|100次
本试剂盒是一种采用了经过改造和优化的M-MLV反转录酶II(RNase H-)（YT394），用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。

使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、 cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。

使用本试剂盒可以轻松完成长度为8 kb及以下基因的反转录(参考图1)，反转录的最大长度可以超过10 kb。在采用M-MLV反转录酶II(RNase H-)（YT394）的情况下，由于缺失了RNase H酶活性，RNA和DNA双链复合物中的RNA不会被降解，这样反转录出来的cDNA的长度就会更长，并且产量更高。


使用本试剂盒对总RNA反转录后，对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见对于0.2-8kb的cDNA可以非常高效地被反转录。

本试剂盒中的M-MLV反转录酶II(RNase H-)（YT394）热稳定性高，最适反应温度为42-45℃，但当温度达到50℃时仍具有很高活性，且可获得较高产量的cDNA。

试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。

试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。

本试剂盒用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时足够进行20个cDNA第一链样品的合成。

产品组份：
M-MLV反转录酶II(RNase H-)——————————20μl
Reaction Buffer (5X)————————————0.1ml
RNase Inhibitor (20U/μl)——————————20μl
dNTP Mix (10 mM each)————————————40μl
Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl)——————20μl
Random Hexamer Primer (0.2μg/μl)——————20μl
DEPC-treated Water——————————————0.3ml

储存条件：-20℃。