C段插入TARGET标签的pEBMulti-Puro载体

四步致胜奇招 高效克隆你值得拥有（上篇）

的序列就好了。 无缝克隆技术应运而生 通过引物在目标片段两端添加一小段跟载体两端同源的序列，扩增得到的目标片段和线性化载体对应的末端同源，用特定外切核酸酶消化末端数个碱基得到粘末端，就能互补结合——全程不会加入额外的碱基！ 几家克隆技术领先的公司先后推出了基于同源序列的无缝组装克隆技术，取代内切酶甚至连接酶，能够实现在任意载体的任意位置无缝（无痕）插入任意长度的目标片段——任意大小、任意 GC 含量、甚至内部重复序列结构，统统都能实现精确的正向无缝克隆——没有插入方向的困扰，没有找酶切位点对眼神的繁琐，基本能避免

用于蛋白质表达和纯化的pET-32α（+）载体的构建

加热灭活酶。通过凝胶提取试剂盒纯化消化的pET-32α（+）载体骨架和从pMD18-T载体切下的基因片段。用T4 DNA连接酶在23℃下用pET-32α（+）载体骨架连接基因片段1小时，载体末端和插入末端的比例为1：3（fmol）。将10μl连接反应与100μl感受态大肠杆菌 BL21（DE3）在冰上混合10分钟，并将混合物在42℃下孵育90秒。加入800μlLB并在37°C下孵育40分钟。涂在含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB平板上。在37°C孵育过夜。通过菌落PCR筛选插入物的存在或制备

【原创】表达载体的选择及构建方法

型质粒 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核