ROS活性氧检测试剂盒(cellRox Green)

特别提示：包括ROS活性氧检测试剂盒(cellRox Green)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：ROS活性氧检测试剂盒(cellRox Green)
产品规格：200T

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括过氧化*(H2O2，Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH，Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2，Singlet oxygen)、一氧化*(代"氮")(NO，Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO•，Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO•，hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-，Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2·-)。超氧阴离子遇水生成H2O2，同时过氧化*也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成，生成的过氧化*在髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH·，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。
CellROX Green活性氧(ROS)检测试剂盒是一种利用荧光探针CellROX Green进行活性氧检测的试剂盒。CellROX Green本身荧光较弱，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，氧化产物可掺入染色体DNA中，荧光强度增大，产生明亮的绿色荧光。根据活细胞中绿色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS经典检测方法。在激发波长488nm，发射波长520 nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内活性氧水平。可以提供细胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、细胞代谢、氧化应激、细胞膜流动性、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种检测试剂盒产品。

储存条件：-20℃避光保存。
有效期：六个月。

※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制：本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新：我公司会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说明书，可能是不同的版本。需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全：使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

注意事项：
1．正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。
2．螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
3．禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
4．样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
5．最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
6．实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。

产品特点：
● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
● 背景低，灵敏度高；
●线性范围宽，使用方便。
检测方法：
流式细胞仪
荧光显微镜
激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞
● 贴壁细胞
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
仪器：
● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长488 nm，发射波长520 nm。
●离心机● 移液器●冰箱●冰盒
试剂：
● PBS缓冲液(pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液phosphate buffer saline/Dμlbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl)
●或者HBSS(Hank"s Balanced Salt Solution；With：Calcium Magnesium Glucose；Without：Phenol Red。Components：CaCl2(anhydrous)140mg/L(1.261mM)、MgCl2-6H2O 100mg/L(0.493mM)、MgSO4-7H2O 100mg/L(0.407mM)、KCl 400mg/L (5.333mM)、KH2PO4 60mg/L(0.441mM)、NaHCO3 350mg/L(4.167mM)、NaCl 8000mg/L(137.931mM)、Na2HPO4(anhydrous)48mg/L(0.338mM)、D-Glucose 1000mg/L(5.556mM))
耗材：
●离心管● 吸头

使用方法：
使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
●荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
●探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
●对于药物作用时间较短(2小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。
●阳性对照诱导剂可以按照1:1000的比例使用。例如标记好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照诱导剂的浓度。● CellROX Green在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。
●对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化，很多细胞内的ROS绝对水平较低，需要根据实际情况适当延长孵育时间。
● CellROX Green探针可以根据需要的用量分装后冻存，避免反复冻融。
● CellROX Green不可以一次性全部稀释后长期保存不用，稀释后稳定性变差，有效期缩短。
●标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
CellROX Green探针配制：
根据需要的用量，用新鲜无血清培养基或HBSS缓冲液稀释CellROX Green探针后充分混匀，避光保存备用。
探针使用终浓度200-1000倍稀释。一般预实验起始浓度按500倍即可。
CellROX Green探针标记：
1．CellROX Green溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度，终浓度200-1000倍稀释，以此染色液更换细胞培养基或灌流液；也可直接向无血清细胞孵育液体或灌流液中加入CellROX Green探针溶液至所需浓度。
【注】
●检测贴壁细胞时，荧光显微镜检测可以原位染色也可以消化下来后染色，流式检测消化下来后染色。
2．依据细胞ROS含量的不同，CellROX Green终浓度可选择在200-1000倍稀释的范围，孵育时间可选择30分钟-4小时，在37℃或室温进行避光孵育。
3．孵育结束后，用PBS等新鲜缓冲液清洗细胞或组织。漂洗时间要短。
荧光显微镜观察：
1．对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
2．荧光显微镜下观察。
流式细胞仪分析：
1．染色并洗涤细胞后用0.5～1 ml冷PBS重悬细胞(5～10万)。
2．采用488nm波长激发，发射波长520 nm，测定待测细胞平均荧光强度。