1. 直接研磨法(推荐):
a. 新鲜植物组织称重后取100mg 迅速剪成小块放入研钵(冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg 放入研钵), 加入1 ml 裂解液RPA 室温下充分研磨成匀浆,注意应该迅速研磨让组织和裂解液RPA 立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
b. 将裂解物转入离心管,剧烈摇晃振荡15 秒,13,000rpm 离心5-10 分钟,沉淀不能裂解的碎片。
c. 取480μl 裂解物上清(在不超过RNA 吸附柱能力的情况下可以取更多或者全部上清,这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5 体积),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
d. 立刻接操作步骤的步骤3。
2. 液氮研磨法:
a. 取500μl 裂解液RPA,转入1.5ml 离心管中。
b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后,取50mg 细粉转入上述装有RPA 的离心管, 立即用手剧烈振荡20 秒,充分裂解。
c. 用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30 秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
d. 将裂解物13000rpm 离心5-10 分钟,沉淀不能裂解的碎片。
e. 取裂解物上清(在不超过RNA 吸附柱能力的情况下可以取更多的上清,这样可以提高产量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5 体积),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
f. 立刻接操作步骤的步骤3。
注意:以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理,可以提高产量。也就是使用1ml 的裂解液RPA和100mg的样品。