Roche货号10976776001切口平移试剂盒(别名:切

通过切口平移法对DNA进行放射性或非放射性标记的试剂盒。该方法利用DNA酶和DNA聚合酶的组合来切割DNA螺旋的一条链，然后在聚合酶检查或“校对”切口位点时掺入标记的核苷酸。

切口平移试剂盒已用于基于FISH（荧光 原位 杂交）的蜱和细菌人工染色体的标记。其已被用于标记探针（基因组DNA）以获得GISH（基因组 原位 杂交）信号。

该试剂盒可用于经放射性或修饰的dNTP标记的DNA。通过切口平移标记的探针可用于许多不同的杂交技术中。其包括将探针用于：

• 通过菌落或噬斑杂交对基因库进行筛选
• DNA或RNA转移杂交
• 原位杂交
• 重新关联动力学研究

热灭活：通过加入1 μl 0.5MEDTA（pH8.0）和/或加热至65℃10分钟来终止反应。

切口平移法是基于DNase I在Mg²⁺存在下以低酶浓度将随机分布的切口引入DNA的能力来实现的。大肠杆菌 DNA聚合酶I使用切口的3′-OH末端作为引物，以5′→3′方向合成与完整链互补的DNA。DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切活性可同时去除合成方向上的核苷酸。聚合酶活性可依次利用同位素标记的或半抗原标记的脱氧核糖核苷三磷酸对去除的核苷酸进行替换。在低温（+15℃）下，反应中未标记的DNA因此被新合成的标记DNA所取代。

测定时间：45分钟

比活度：特异性标记的水平和掺入率取决于底物DNA与标记的脱氧核糖核苷三磷酸的比例，例如，在含有0.1 μgDNA和20 μCidXTP或0.5 μgDNA和100 μCidXTP的测定中，所获得的动力学和标记水平是相同的。
标准测定可获得3×10⁸ dpm/ μg的比活性，相当于在35分钟内，不同底物DNA（例如，pBR322、λDNA、DNA片段）的掺入比率达到65％。

样品材料

• 超螺旋和线性化的质粒DNA
• 超螺旋和线性化的粘粒DNA
• BAC DNA或人类基因组DNA
• 纯化的PCR产物

注意：不需要在切口平移之前对模板进行变性。

1个试剂盒包含7种组分。

工作浓度：T7、T3或SP6 RNA聚合酶的推荐工作浓度为1 mM。
工作溶液：DNA
DNA必须在低盐浓度溶液中工作。

dATP，dGTP，dTTP

• 如果重复使用相同标记的脱氧核糖核苷三磷酸，我们建议为方便起见，制备其他三种三磷酸盐的等比混合物。
• 通过制备溶液2、溶液4和溶液5的1:1:1混合物来制备dATP、dGTP、dTTP混合物。