LightShift 化学发光EMSA试剂盒（LightSh
ift Chemiluminescent DNA EMSA Kit）100 reactions 20148 PIERCE 现货- 询价
- Thermo
- 20148
- 美国
- 2025年10月18日
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LightShift* EMSA检测的原理与Western blot类似。生物素末端标记的双链DNA与核提取物或者纯化的因子共同孵育，之后进行非变性胶电泳。然后将DNA快速（30分钟）转到正极（带正电）的尼龙膜上，紫外交联，使用HRP标记的链亲和素进行孵育，再与底物孵育。从标记到获得结果的整个实验流程可以在一天内完成（如图）。
整个实验中要求实验者准备的是已纯化的末端生物素标记的靶DNA，需要检测的蛋白提取物，尼龙膜和基本的电泳设备。靶DNA可以通过直接合成产生带有生物素标记的5’或3’末端，或者可以在合成之后使用Thermo Scientific 生物素DNA3´末端标记试剂盒（见下页产品目录号89818）标记上生物素。可通过不同方法获得核、胞质或全细胞蛋白提取物，包括Thermo Scientific NE-PER 核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒(产品目录号78833)。
产品特点：
• 含有EBNA对照体系，可以帮助初次使用者进行实验，并理解用于确定特异结合相互作用的方法。
• 极好地用于检测核提取物中的低丰度蛋白。
• 灵敏度优于放射性检测和digaoxin检测方法。
• 与以往建立的通用的用于检测DNA-蛋白相互作用的结合条件相互兼容。
Thermo Scientific LightShift EMSA试剂盒实验操作的时间流程
使用EBNA对照系统得到的EMSA结果。含有EBNA-1结合序列的60bp生物素标记的双链DNA与含有过表达EBNA-1的提取物共同孵育。向结合缓冲液中加入50ng/μl poly(dI•dC)，10%甘油和0.05% NP-40。使用X光片曝光30秒。
四种不同DNA-蛋白复合物的化学发光EMSA。生物素标记的靶双链长度范围在21bp-25bp。EBNA反应中添加2.5%甘油和0.05%NP-40，AP1反应中添加10%甘油。Oct-1，AP1和NFκB转录因子来自于Hela细胞的核提取物。ENBA-1提取物由试剂盒提供作为对照。体系中加入的未标记的特异性竞争序列（使用时）的摩尔量是标记的靶序列的200倍。对于ENBA、Oct-1和AP1体系X-ray底片曝光时间为2分钟，NFκB体系曝光时间为5分钟。
Thermo Scientific LightShift EMSA试剂盒与基于digaoxin的EMSA试剂盒及放射性方法的比较。A）灵敏度比较。将标记的DNA双链进行连续稀释，使用6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，并按照操作手册指导进行检测。使用LightShift EMSA试剂盒与放射性法(2000cpm32P/femtomole)可获得相似的灵敏度（<50 attomoles），尽管32P标记的DNA明显需要更长的曝光时间。使用两种化学发光试剂盒进行相同时间的曝光，结果显示LightShift EMSA试剂盒的灵敏度大约是digaoxin试剂盒的八倍。B）EMSA表现。将含有转录因子Oct-1结合序列的22bp双链进行标记，用于LightShift EMSA试剂盒和基于digaoxin的EMSA试剂盒检测，或使用T4多核苷酸激酶（40000cpm/反应）进行32P标记用于传统的放射性EMSA检测。结合反应的条件均一化为20fmol双链与6.8μg HeLa细胞NE-PER核提取物（图示处）孵育。化学发光试剂盒按照操作手册指导使用。对于放射性EMSA，凝胶直接曝光于X光胶片。
参考文献
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Tarumi, T., et al. (2002). J. Biol. Chem.277(21), 18510-18516.
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文献和实验Introduction to the EMSA (Gel Shift) Technique
Chemiluminescent EMSA Kit, Product # 20148 ) and a kit to facilitate labeling DNA with biotin (Biotin 3´ End DNA Labeling Kit, Product # 89818 ). The LightShift EMSA Kit utilizes Pierce’s patented SuperSignal Chemiluminescent Detection Technology to offer detection
激活－核转运检测试剂盒仅染色p65，不染色RelB、C-Rel、p50和p52。使用本试剂盒染色后NF-κB呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光.思考信号转导和检测的理论 我做了这样的回答(个人意见.大家可以讨论!)： 这种理论上来讲可行,但是实际操作可能拿不到你想要得结果,原因很简单,凭染色来判断是很难区分程度上的差异的,就比如做WB实验,经典的还是化学发光的方法,显色的方法只能得到信号比较强的蛋白,遇到信号比较弱的蛋白就误差很大了, 第二点,并不是所有能进核的蛋白都有结合DNA
： 1）一般先做一般的EMSA测定，成功后才考虑做Super-Shift EMSA实验。 2）不是所有的抗体都可以用于Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于Super-Shift EMSA。 3）抗体的浓度要高。一般10-20ul的反应液需要使用0.5-1ul原倍的抗体。 3）为减少非特异性反应，尽量使用纯化的抗体。 4）单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA，但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种
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