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北京诺博莱德科技有限公司
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SOD Assay Kit - WST是由同仁化学研究所（Dojindo）开发的检测超氧化物歧化酶（SOD）活性的试剂盒，它具有以下特点：
1、灵敏度高，结果准确可靠
2、操作简便，重复性好
3、采用96孔板检测，省时省力
4、可一次检测多个样品
5、采用WST染色方法，可以测定100% SOD抑制率
6、众多SCI论文支持
WST®：WST是同仁化学研究所的注册商标
1、灵敏度高，结果准确可靠
2、操作简便，重复性好
3、采用96孔板检测，省时省力
4、可一次检测多个样品
5、采用WST染色方法，可以测定100% SOD抑制率
6、众多SCI论文支持
WST®：WST是同仁化学研究所的注册商标
该产品在“丁香园”（www.dxy.cn)旗下商务平台“丁香通”上的展示链接为http://www.biomart.cn/infosupply/3014050.htm。
超氧化物歧化酶（SOD）能够催化超氧阴离子（O2•-）歧化，生成过氧化氢以及单质氧，是一种重要的抗氧化酶。哺乳动物细胞溶质中的SOD呈绿色，并且由两种亚单位构成，一种含有铜，另一种含有锌（Cu/Zn-SOD）。线粒体和细junSOD为红紫色并含有锰（Mn-SOD）。E.coli含有Mn-SOD和Fe-SOD。
为了测定SOD的活性，研究人员尝试了许多间接的或者直接的方法，其中，NBT的间接法zui为常用，因为它很方便。但是，NBT法有几个缺点，例如生成的染料水溶性差，而且会和黄嘌呤氧化酶的还原型发生反应。虽然cytochrome C法也常被用来做SOD检测，但它和超氧化物反应过于剧烈，不能测定低水平的SOD。SOD Assay Kit-WST®使用了Dojindo自己发明的易溶于水的噻唑盐：WST®-1（2-(4-碘苯基)-3-(4-****)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐,二钠盐），能够和超氧阴离子反应生成水溶性的染料，因此可以简便地进行SOD的检测。WST®-1与超氧阴离子反应的剧烈程度比cytochrome C小70倍；因此，它的检测灵敏度非常高，并且能够通过将样品用buffer稀释，使背景的吸光度zui小化。WST®-1不会和黄嘌呤氧化酶的还原型发生反应，因此，能够检测SOD100%的抑制率。WST®-1被超氧阴离子还原的比率与黄嘌呤氧化酶的活性线性相关，并且会被SOD所抑制（见下图）。因此，SOD或者SOD类似物的IC50(50%的抑制浓度)就能用比色法来测定。
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SOD检测机理：
WST®-1 甲臜的光谱：
WST® Solution………..1 ml × 1管
Enzyme Solution………20 μl × 1管
Buffer Solution……. 11 ml × 2 瓶
Dilution Buffer………. 10 ml × 1瓶
试剂盒内含：500 tests
WST® Solution……… 5 ml × 1 瓶
Enzyme Solution…… 100 μl × 1 瓶
Buffer Solution……… 100 ml × 1 瓶
Dilution Buffer……… 50 ml × 1 瓶
检测步骤
1） 将20 μl 样品溶液或水加入到每个孔中。
2） 按照表1所示，向各孔中加入WST® Working solution， Dilution buffer和Enzyme working solution。a)
3） 在37℃下培养20分钟。b)
4） 测定450 nm处的O.D.值
a） 由于加入Enzyme working solution后立即会有超氧化物生成，需要用多通道移液器来加Enzyme working solution以缩短时间，减少各孔间的误差。
b） 如果酶标仪具有控温功能，请将温度保持在37℃。
抑制率的计算和典型标准曲线
SOD抑制活性(抑制率%)=｛[(Ablank 1-Ablank 3)-(Asample-Ablank 2)]/(Ablank 1-Ablank 3)｝×100
Ablank 1：blank 1的吸光度
Ablank 2：blank 2的吸光度
Ablank 3：blank 3的吸光度
Asample：样品孔的吸光度
样品溶液的制备
细胞（贴壁细胞：9×106个，Leukocytes：1.2×107个）
1. 用刮刀刮下细胞，4℃，2,000 g离心10分钟，弃上清。
2． 用1 ml PBS 洗净细胞，随后4℃，2,000 g离心10分钟，弃上清。重复次步骤一次。
3. 在-20℃下放置20分钟，再在37℃水浴10分钟。这个步骤重复两遍使细胞膜破损。
4. 加入1 ml新的PBS，如果必要的话，在冰浴器上用超声降解细胞裂解物（60 W，0.5 s间隔，15分钟）。
5. 在4℃，10,000 g下离心15分钟
6. 移出上清液用PBS稀释，制成样品溶液。
植物或者蔬菜（200 mg）
1. 加入1 ml蒸馏水，用带有研磨球的均质器使样品均匀。
2. 用滤纸过滤，将滤液冻干。
3. 测量冻干后的样品重量，然后用0.1 M的磷酸缓冲液（pH 7.4）溶解，制成样品溶液。
组织（100 mg）
1. 用生理盐水清洗组织，尽可能将血除去。用纸巾将组织上的水分吸干，然后称重。
2. 加入400-900 μl 蔗糖缓冲液（0.25 M 蔗糖，10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.4），用Teflon匀浆机将样品匀浆。如果必要的话，在冰浴器上将样品超声破碎，（60 W，0.5 s间隔，15分钟）。
3. 匀浆后的样品在4℃下，10,000 g离心15分钟，将上清液移入新的试管中。
4. 用蒸馏水稀释上清液，制成样品溶液。
茶（抗氧化剂活性检测）
1. 向10 g茶叶中加入60 ml水，静置2.5分钟。
2. 将提取物用滤纸过滤一次，然后再用0.45 μm的过滤膜过滤一次。
3. 将滤液用蒸馏水稀释，制成样品溶液。
红细胞或血浆
1. 取2-3 ml抗凝处理后的血液（如最终浓度约为10 U/ml肝素钠）在4℃，600 g，离心10分钟。
2. 用生理盐水稀释上清液，作为血浆样品。加生理盐水至沉淀中，制成等量的悬液。
3. 将该悬液在4℃，600 g，离心10分钟，弃上清液。
4. 加入等量的生理盐水重复步骤3两次。
5. 在沉淀中加入4.0 ml蒸馏水，制成悬液。加入1 ml乙醇和0.6 ml氯仿。
6. 将混合后的液体，盖紧盖子，在4℃用震荡器强烈震荡15分钟。
7. 将混合液在4℃，600 g，离心10分钟，随后将上层的水乙醇层小心移入一支新的试管中。
8. 取出0.1 ml的水乙醇层，将蒸馏水0.7 ml加入到里面。用0.25%的乙醇稀释，制成样本溶液。
胞外SOD（EC-SOD）
1. 制备1支0.5 ml的Con A-sepharose 柱，用PBS平衡。
2. 将组织匀浆的上清液过柱，并在室温下静置5分钟。
3. 用总共10 ml的PBS洗柱。
4. 加入1 ml 0.5 M的α-methylmannoside/PBS,收集洗出液。重复5次。
5. 不用稀释，直接用洗出液进行后续的SOD检测。如果SOD的活性足够高，也可以用PBS稀释样品。
酒（抗氧化活性检测）
1. 用0.45 μm的过滤膜过滤一次。
2. 用蒸馏水稀释滤液，制成样品溶液。
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