M-MuLV反转录酶(没有RNase H活性)厂家

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名称：M-MuLV反转录酶(没有RNase H活性)厂家
编号：JN0011
规格：10kU
英文名：BalbScript Reverse Transcriptase
品牌：百奥莱博
产地：北京
  本制品是通过基因重组技术克隆表达的缺失突变型RNase H-的M-MuLV反转录酶。一般的野生型M-MuLV（Moloney Murine Leukemia Virus）具有以下几种活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；RNase H活性。由于RNase H能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA，因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶的RNase H活性缺失，延伸能力强，可用于较长的cDNA合成，高比例的全长cDNA文库的构建以及Real Time RT-PCR反应等。

产品组成：

 

组份	JN0011-10kU
MuLV反转录酶(200U/μl)	25μl
5×M-MLV Buffer	1ml

产品用途：
1、1st-Strand cDNA的合成。
2、cDNA Probe的制备。
3、RT-PCR反应以及Realtime RT-PCR反应。

注意事项：
1、用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
3、纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和*酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。

实验步骤：
第一链cDNA合成反应体系：
1、按右侧表格顺序加入的反应物。
2、可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟，冰上冷却，离心，再置于冰上冷却。
3、轻轻混匀，离心。
4、如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物，42℃孵育60分钟。如果使用随机六聚体引物，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟。
5、75℃加热5min终止反应。
反应产物可直接用于PCR反应或者在-20℃保存少于一周的时间。如想延长保存时间，建议使用-70℃保存。

应用实例：

图例一）小鼠胚肝总RNA RT-PCR扩增。
泳道1-6总RNA量分别为10ng，1ng，0.1ng，0.01ng，0.001ng，0ng；20ul体系中反转录后取1ul用于PCR扩增。目的基因：GAPDH。

质量保证：经多次柱纯化，SDS-PAGE检测纯度大于95%，PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。

活性定义：以Poly（rA）•Oligo（dT）为模板/引物，在37℃、10分钟条件下，掺入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。

常用反应体系：

模板RNA	总RNA（0.1 ng～5μg） poly(A) mRNA（10 pg～0.5μg） 特异性RNA（0.01 pg～0.5μg）
引物	Oligo (dT)18引物1μl 随机六聚体引物1μl 基因特异性引物15-20 pmol
5×Reaction Buffer	4ul
RNA酶抑制剂(20U/ul)	1ul
dNTP(各10mM)	2.0μl
M-MuLV反转录酶（200U/ul）	1μl
ddH2O(Nuclease Free)	至20μl

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