热启动高保真酶 核酸扩增(PCR)

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括热启动高保真酶 核酸扩增(PCR)在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：热启动高保真酶 核酸扩增(PCR)
编号：SY0038
规格：100U
英文名：HotStart Pfu DNA Polymerase
品牌：百奥莱博
产地：北京
HotStart Pfu DNA Polymerase在Pfu DNA Polymerase的基础上添加了在常温下能够抑制5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性的两种单克隆抗体，可进行高特异性的热启动(Hot Start)PCR，扩增产物为平端。Pfu DNA Polymerase是经过基因工程改造的，新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。其错配率是普通Taq酶的1/52，是Pfu酶的1/6；且扩增速度可以达到15秒/kb。

本产品中附带的5×HS Pfu buffer对于简单或复杂模板、短片段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。缓冲液中已经含有10 mM Mg2+ (1×终浓度为2 mM)，可以使用产品中提供的DMSO/MgSO4对反应体系进行优化。另外，产品中附带的PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。

产品组份：
5×HS Pfu buffer(with 10 mM MgSO4)：1.25 ml
25 mM MgSO4：1 ml
dNTP Mix(10 mM each)：100 μl
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)：100 μl
5×PCR Enhancer：500 μl
DMSO：100 μl
10×Loading buffer：1.25 ml

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃ 30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位（U）。
储存条件：-20℃

质量控制：
核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-HindⅢ在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA在74 ºC下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品，以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因。35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。
功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品，以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的8.2 kb条带。
功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng λDNA为模板扩增30个循环，取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察到单一的15 kb条带。

使用方法：
1. 所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分摇匀。为了防止HS Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶最后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。5×HS Pfu buffer请勿长时间敞口放置。

 

ddH2O	to 50 μl
d5×HS Pfu buffer (with 10 mM MgSO4)	10 μl
d25 mM MgSO4a	optional
ddNTP Mix(10 mM each)b	1 μl
dDMSOc	optional
d5×PCR Enhancerd	optional
d模板DNAe	optional
dForward Primer(10 μM)	2μl
dReverse Primer(10 μM)	2 μl
HS Pfu DNA Polymerase(1 U/μl)f	1 μl

【注】：
a. 对于大多数PCR反应，Mg2+最佳终浓度为1.5-2 mM。体系中已含有终浓度为2 mM Mg2+，如有需要，可用25 mM MgSO4，以0.2-0.5 mM为间隔向上摸索Mg2+最佳使用浓度。
b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
c. 扩增子GC含量>60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。
d. 推荐仅当扩增子GC含量>60%且优化条件也无法正常扩增时使用；可能会降低保真度。
e. 不同模板最佳反应浓度有所不同，下表为50 μl反应体系推荐模板使用量：

模板种类/扩增长度	＜1 kb	1 kb～10 kb	＞10 kb
基因组DNA	50 ng～250 ng	100 ng～300 ng	150 ng～400 ng
质粒或病毒DNA	10 pg～20 ng	10 pg～20 ng	1 ng～30 ng
cDNA	1～5 μl(不超过PCR反应总体积的1/10)

f. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应。然而，根据扩增子的长度和复杂程度不同，可将HS Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50 μl，尤其当扩增子长度大于5 kb时。HS Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。

2. 推荐PCR反应条件：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性a	95℃	30 sec～3 min	1
变性b	95℃	5～10 sec	25～35循环
退火c	45℃～72℃	10～30 sec
延伸d	72℃	15～30 sec/kb
彻底延伸	72℃	5～10 min	1

【注】：
a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃，时间为：质粒或病毒DNA，30 sec，基因组2 min，cDNA 3 min；对于高GC含量模板，预变性温度需提升至98℃，变性时间为2～4 min；对于超过10 kb的扩增子，预变性温度需降低至92℃，变性时间不超过2 min。
b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5～10 sec即可。对于高GC含量模板，变性温度需提升至98℃；对于超过10 kb的扩增子，变性温度需降低至92℃，并延长变性时间至15 sec。
c. HS Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此，推荐退火时间设置为10 sec即可。对于一些困难模板，退火时间可在10～30sec之间调整。
d. 对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。对于超过10 kb的扩增片段，需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时，可使用15 sec/kb的延伸时间；使用基因组
cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时，延伸时间应为30 sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加，因此延伸时间请勿超过30 sec/kb。

3. 长片段PCR指南：
*使用高质量的模板；
*使用长引物。将引物加长至Tm值68～72℃，把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性；
*适当提高酶量，但50μl反应体系内不要超过2 U；
*添加DMSO，以1%的浓度递增。调整范围为0%～6%；
*推荐反应条件设置：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	92℃	2 min	1
变性	92℃	5～10 sec	25～35循环
延伸	68℃	15～30 sec/kb
彻底延伸	68℃	5～10 min	1

4. 高GC含量模板PCR指南：
*使用高质量的模板；
*提高变性温度至98℃；
*添加DMSO，以1%的浓度递增。调整范围为0%～8%；
*添加5×PCR Enhancer；
*推荐反应条件设置：

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	98℃	3 min	1
变性	98℃	10 sec	25～35循环
退火	45℃～72℃	10～30sec
延伸	72℃	15～30 sec/kb
彻底延伸	72℃	5～10 min	1

引物设计注意事项:
1）引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；
2）引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；
3）引物3’端尽量避免发夹结构出现；
4）引物的Tm值调整至55℃-65℃之间。
5）引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；
6）引物的GC含量控制在40%-60%之间；
7）正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。

除热启动高保真酶 核酸扩增(PCR)外，我公司正在打折促销以下产品：

·甲叉双丙*(代"烯")酰胺
编号：SY0363
英文名称：Bis-Acrylamide
规格：100g
甲叉双丙*(代"烯")酰胺（Bis-Acryamide），一种白色晶体化合物，生化实验中常作为一种交联剂与丙*(代"烯")酰胺（Acrylamide）一起在催化剂（如核黄素、过硫*(代"酸")铵）的作用下用于聚丙*(代"烯")酰胺凝胶（PAGE胶）的配制，包括SDS-PAGE胶等，主要用于蛋白或核酸的分离。根据丙*(代"烯")酰胺
和甲叉双丙*(代"烯")酰胺的浓度不同，可形成具有不同大小孔径的凝胶，从而分离不同大小的蛋白或核酸。

中文别名：双丙*(代"烯")酰胺；N,N’-亚甲基双丙*(代"烯")酰胺；
英文别名：N,N´-Methylene-Bis-Acrylamide
CAS：110-26-9
分子式：C7H10O2N2
分子量：154.17
外观：白色粉末
纯度：＞99%
pH（1%, 0.1M NaCl）@25℃：5.0
溶解性：溶于水
储存条件：室温，避免受潮
结构式：


注意事项
1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）甲叉双丙*(代"烯")酰胺单体具有毒性，很容易通过皮肤吸入，操作时请务必小心谨慎。
3）建议条件允许的实验人员，购买我司的一系列升级产品，不同程度降低与丙*(代"烯")酰胺/双丙*(代"烯")酰胺接触的可能性。升级系列产品：
a）30% /40%丙*(代"烯")酰胺/双丙*(代"烯")酰胺溶液（浓度比：19:1，29:1，37.5:1）；
b） Fast-UVTM荧光PAGE凝胶预混液（胶浓度：8%，10%，12%，15%），仅需凝胶成像（紫外）即可观察到蛋白的电泳情况，无需凝胶染色；
c）12孔固定浓度或者梯度预制胶（胶浓度：8%，10%，12%，15%；8-16%，4-20%）。


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·通用型Western Blot电泳电转缓冲液
编号：SY0360
英文名称：Universal Electrophoresis and Transfer Buffer (for Western Blot)
规格：1L
Western blot实验首先需要进行电泳分离目的蛋白，然后将分开的蛋白从凝胶转移到固相基质如硝化纤维素膜或PVDF膜上，从而进行随后的免疫印迹检测。Tris-甘*酸是最通用的电泳和转膜缓冲液配方，本品是改进的缓冲液配方，以干粉的形式提供，使用时只需要用去离子水溶解即可。

使用方法：将本品溶解于1 L去离子水中，混匀，即形成1×电泳缓冲液；取800 ml的1×电泳缓冲液加入200 ml乙醇即得到湿转及半干通用电转缓冲液。

注意事项
不建议反复使用或长期放置缓冲液，否则会降低电泳及转膜效果。
储存条件：室温密封

·AhR-Luc荧光素酶报告基因质粒
编号：SY0095
英文名称：AhR luciferase reporter plasmid
规格：1μg
AhR荧光素酶报告基因（报告基因质粒）（AhR luciferase reporter plasimd）是用于检测AhR转录活性水平为目的的报告基因。芳香族化合物受体(Aryl
hydrocarbon receptor, AhR)是一个核受体转录因子。AhR广泛地参与多种细胞内的信号通路,包括核受体信号通路,缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)信号通路,p53信号通
路以及细胞周期信号通路等。AhR通过对细胞内不同信号通路的调节作用从而影响了细胞的生长,增殖以及分化等过程。另外,AhR与癌症的发生和发展也密切相关,在许多的肿瘤细胞中都
发现了AhR的异常表达。

AhR报告基因主要用于检测细胞中AhR的转录活性、药物研究以及基因过表达和RNAi的表性分析等。

pGMAhR-Lu是我公司改造后的哺乳动物真核表达载体，在其多克隆位点插入了多个AhR结合位点，可以高灵敏度地检测AhR的激活水平。同时，对载体中预测出的其它转录因子以外的结
合位点进行了适当的突变，增加了质粒的转录因子结合特异性。由于质粒体积减小，使得AhR报告基因质粒更易于转染。

质粒图谱



注意事项
本质粒未经我公司允许不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人实验室以外的任何人或单位。
为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

使用说明
pGMAhR-Lu可以采用常规转染方法转染哺乳动物细胞。用荧光素酶检测试剂盒或双荧光素酶检测试剂盒进行检测。

储存条件：-20℃。


热启动高保真酶 核酸扩增(PCR)关键词：HotStart Pfu DNA Polymerase,SY0038,热启动高保真酶

KFS195 Annexin V-kFluor647/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒 Annexin V-kFluor647 Apoptosis Detection Kit
SY0434 Anti-V5标签亲和纯化凝胶 Anti-V5 Affinity Gel
SV0303 DpnI限制性内切酶 DpnI Restriction Endonuclease
BTN100841 电泳级β-巯基乙醇 b-Mercaptoethanol，EG
HR0328 溶菌酶 lysozyme
SY0073 MEF2-Luc荧光素酶报告基因质粒 MEF2 luciferase reporter plasmid
BTN131088 荧光素(FITC)标记亲和素 FITC-Avidin
BTN90805 即用型PCR试剂盒(含染料) Instant PCR MasterMix
SV1622 CoA 488
YT361 ATP检测试剂盒 ATP Assay Kit
WE0146 实时荧光定量PCR的预混体系(探针法)(高含量ROX校正染料) BaldStar TaqMan Mixture(High ROX)
BTN120503 藻类RNA柱式提取试剂盒 Algae RNA Column extraction kit
SV0955 T4 DNA 聚合酶
YT008 RNase A (100mg/ml) Ribonuclease A
KFS093 Western转膜液(干粉)
SY0320 10×RIPA裂解液(中)(不含蛋白酶磷酸酶抑制剂) 10×RIPA Lysis Buffer (Medium),without enzyme inhibitors
SV0036 AleI限制性内切酶 AleI Restriction Endonuclease
KFS293 Cisplatin (DNA交联剂/细胞凋亡诱导剂) Cisplatin
HR0121 神经元蛋白提取试剂盒 Neuron protein extraction kit
YT912 伊红染色液 Eosin Staining Solution

我公司强烈推荐核酸扩增(PCR)系列产品，热情期待您的咨询选购热启动高保真酶 核酸扩增(PCR)。