TA快速连接试剂盒(pUC-T)特价优惠

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北京百奥莱博主要从事生物试剂的生产和销*(代"售")，产品线涵盖TA快速连接试剂盒(pUC-T)特价优惠在内的分子生物学试剂产品，还包括PCR及荧光定量PCR、核酸提取试剂盒类、样本核酸保护试剂、核酸提取、克隆与转化、蛋白纯化、蛋白检测、免疫组化、细胞凋亡与抗体等。

名称：TA快速连接试剂盒(pUC-T)特价优惠
编号：WE0249
规格：20次
英文名：pUC-T TA Cloning Kit
品牌：百奥莱博
产地：北京
  pUC-T TA载体是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在EcoR V酶切位点处切开，在两侧的3"端添加T而成。由于大部分耐热聚合酶反应时都会在PCR产物的3"端添加一个A，它可以与pUC-T 3"端的T互补连接，因此可大大提高PCR产物的连接和克隆效率。
  试剂盒中配备高效率的T4 DNA Ligase和为快速高效DNA连接优化的2×Quick Ligation Reaction Buffer。连接效率相当于用T4 DNA Ligase 进行常规连接1小时。带有插入片段的重组子可根据α互补原理，进行蓝白斑筛选，判断载体中有无外源基因的插入。克隆后可以用BcaBEST Sequencing Primers和 M13通用引物对PCR产物进行测序。

试剂盒组成：

 

组份	20次
pUC-T(50ng/μl)	20μl
Control Insert(50ng/μl)	10μl
Quick T4 DNA Ligase	20μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	120μl

注意事项：

1、Insert DNA 要求
1)连接使用的PCR片段3’末端应带有“A”尾。有些高保真DNA聚合酶，如我公司的Pfu扩增的PCR产物是平滑末端，可使用加A试剂盒加上A尾后，再进行T载体克隆。
2)PCR产物建议进行切胶回收纯化后再进行T载体克隆，以免PCR产物中的非特异片段或残存引物等杂质影响。推荐使用WE0168快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

2、连接反应要求
1)本试剂盒能使大多数连接反应在25℃条件下5分钟甚至更短时间内达到反应终点，增加反应时间反应效率不会增强。如用快速连接反应1小时后，转化效率会明显降低；如25℃快速连接反应过夜，则转化效率会下降到75%。
2)2×Quick Ligation Reaction Buffer含有ATP，使用前置于冰上使其融化后充分混匀，建议初次使用分装成小管冻存，避免其反复冻融影响DNA连接效率。
3)由于T4 DNA Ligase中含有甘油，比较粘稠容易挂壁，建议使用之前短暂离心将液体收集到管底，取样时枪头尽量不要深入液面太深，以免粘在枪头上造成损失。
4)如快速连接产物用于电转，因快速连接反应体系中的PEG会影响电转效率，建议使用离心柱将连接产物进行DNA纯化(如WE0170快速DNA产物纯化试剂盒)后再进行电转。

3、感受态细胞要求
建议使用高效的热击转化感受态细胞，这样才可能得到比较理想的阳性克隆，如需进行蓝白筛选，宿主细胞必须具有正确的基因型(F´编码的【lacZ ΔM15】)产生ω片段，才能与载体DNA产生的LacZ α 多肽结合，表现出β-半乳糖苷酶活性(α互补)。pUC-T TA载体以pUC18载体为基础构建而成，因此，适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用。推荐使用本公司WE0251 TOP10感受态细胞、WE0252 DH5α感受态细胞。

4、阳性克隆筛选
阳性DNA片段成功插入至pUC-T Vector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。

5、阳性对照
为了确认实验操作的正确性，以及实验试剂的有效性，我们建议使用本试剂盒中配备的Control Insert(750 bp)进行阳性对照实验。

使用方法：

1、按以下体系配制反应液：

成分	反应体系	对照体系
pUC-T	1μl	1μl
DNA 插入片段	0.1 -0.3 pmol	--
Control Insert DNA	--	1μl
2×Quick Ligation Reaction Buffer	5μl	5μl
Quick T4 DNA Ligase	1μl	1μl
RNase -Free Water	补足至10μl	补足至10μl

注：Insert DNA的使用量：在进行克隆时，Vector DNA和 Insert DNA的摩尔比一般为：1:2-1:10，可根据实验情况选择适当的Vector DNA和 Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA的使用量=nmol数×660×Insert DNA bp数。本载体1μl(50ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

2、轻轻混合，短暂离心。25℃反应5分钟。
注意：反应时间不要超过15分钟，否则会降低连接效率。
3、反应结束后，将DNA连接产物存放于0-4℃，而后进行转化实验；也可将DNA连接产物置于-20℃保存。
注意：勿进行加热失活反应。
4、将连接产物加入50μl感受态细胞中(将感受态细胞置于冰上融化)，冰浴30分钟。
注意：用化学法转化时，连接产物的加入量不要超过感受态细胞体积的10%。
5、42℃热击45秒钟，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
6、加入450μl无菌SOC或LB培养基，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟，使菌体复苏。
7、根据实验要求，取适量已转化的感受态细胞，加到含有X-Gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃，直至液体被吸收后，倒置培养，37℃培养12-16小时。
8、计算白、蓝色菌落，挑选白色菌落，使用PCR法或酶切法鉴定插入片段是否正确。



储存条件：-20℃。

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·罗丹明标记驴抗小鼠IgG(H+L)
编号：WE0367
英文名称：Donkey Anti-Mouse IgG,Rhod(TRITC)Conjugated
规格：100μl
本产品为TRITC标记的经抗原亲和纯化的驴抗体，特异识别小鼠IgG重链和轻链，检测灵敏度高，本底低，稳定性好。

荧光素标记抗体广泛应用于免疫学的研究。TRITC(四甲基异硫*酸罗丹明)为罗丹明的衍生物，激发后呈现明亮的橙红色荧光。与FITC的黄绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。

免疫原：小鼠IgG
缓冲液：0.01M PBS，50%甘油，pH7.6
稳定剂：15 mg/ml BSA(不含IgG和蛋白酶)
防腐剂：0.05%叠氮*
荧光团：TRITC，Amax=550; Emax=570
应用范围：对于大多数实验(1：50-200)

·血清血浆尿液游离RNA提取试剂
编号：WE0201
英文名称：RNAtiqu Circulating RNA Extraction Reagent
规格：50ml
  本品特别适用于从血清、血浆中分离纯化包括microRNA和其他小RNA(<200nt)在内的总RNA。本品灵活处理不同起始量的样品，在有效裂解样本的同时，可有效保存RNA的完整性，提取的总RNA完整性好，无蛋白和DNA污染，提取的RNA可用于RT-PCR、Northern Blot和分子克隆等下游实验。

自备试剂：*仿、异丙醇、75%乙醇、无RNase的水(新开封或提取RNA专用)。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、预防RNase污染，应注意以下几方面：
① 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
② 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
③ 配制溶液应使用无RNase的水。
④ 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2、提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取得率和质量。
3、本品中含有*酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。
4、样品用游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂匀浆后，如不即刻加入*仿，置于-70℃可放置一个月以上。
5、保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2～8℃可以保存一周，-20℃条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成cDNA，Northern Blot等。
6、若下游实验对DNA非常敏感，建议用不含RNase的DNase I(货号：WE0213)对RNA进行处理。

操作步骤：
1、取200μl新鲜或者冻存的血清或血浆，加入3倍体积的游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂。振荡30秒，充分混匀。
注意：样本加入游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂后，可能会出现沉淀，经过振荡混匀后，沉淀基本消失。若仍有少量沉淀，不影响下游实验，可继续操作。
2、将处理后的样品在室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
3、向以上溶液中加入*仿，每使用1ml血清/血浆样本专用总RNA提取试剂加入0.2ml*仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟。
注意：如不能涡旋混匀，可手动快速颠倒混匀2分钟。
4、4℃ 12000rpm离心20分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA 主要在水相中，把水相转移到一个新的无RNase的离心管(自备)中。
5、在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置30分钟。或-20℃沉淀过夜，效果更佳。
6、4℃ 12000rpm 离心20分钟，弃上清。
注意：离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
7、加入75%乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂加入1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
8、4℃ 12000rpm离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。
注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
9、室温放置2-3分钟，晾干。加入30-100μl无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。
注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。

储存条件：2～8℃。

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