Amelogenin/MAME mRNA原位杂交试剂盒价格

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名称：Amelogenin/MAME mRNA原位杂交试剂盒价格
编号：ZN0054
产地：国产|进口
规格：100T
品牌：百奥莱博
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.Amelogenin/MAME mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高*(代"辛") 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加*化*17.6g，柠檬酸三*(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加*化*30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖*酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高*(代"辛")：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲*透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖*酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Amelogenin/MAME的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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·即用型免疫组化试剂盒(SABC-AP)(山羊IgG)
编号：ZN1826
规格：1盒
适于一抗为山羊来源的抗体
产品规格：1KIT
保存条件：4℃可保存一年，应避免冷冻。
工作原理：
SABC 是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍，等电点 pI=6.0~6.5，对组织和细胞的非特异吸附很低。根据研究，SABC 大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。大量的酶可以保证 SABC 具有很高的敏感性。所以 SABC 兼具高敏感性，低背景和操作简便等优点。SABC不仅有很强的信号放大作用，而且非常稳定。
试剂盒内容:
1．正常兔血清封闭液 6ml/12ml
2．生物素标记兔抗山羊IgG 6ml/12ml
3．SABC—AP(链酶亲和素—碱性磷酸酶)6ml/12ml
4．BCIP/NBT 显色剂(×20)0.5ml/1ml
5．水溶性封片剂 6ml/12ml
6．中性核固红 6ml/12ml
石蜡片染色步骤:
1．石蜡切片，常规脱蜡至水。
2．根据需要选择抗原修复方式及强度。可热修复、酶修复或不修复。
3．封闭。滴加正常兔血清封闭液,37℃孵育30分钟。甩干，勿洗。
4．滴加适当稀释的一抗(山羊IgG)，37℃孵育1~2 小时或 4℃过夜。0.01M TBS洗5分钟×3次。
5．滴加生物素标记兔抗山羊IgG ,37℃度孵育30分钟。0.01 M TBS洗5分钟×3次。
6．滴加 SABC—AP,37℃孵育30分钟。0.01 M TBS洗5分钟×4次。水洗1次。
7．显色:BCIP/NBT 用 0.01M TBS(pH9.0-9.5)按 1：20的比例稀释，混匀后加至切片。镜下控制反应时间。蒸馏水洗涤。
8．核固红轻度复染。水洗,干燥后水溶性封片剂封片。
建议：
1．对于 AP(碱性磷酸酶)显色系统，请用不含磷酸根的缓冲液洗涤，如 TBS 缓冲液。
2．热修复可选用枸橼酸盐缓冲液、EDTA 抗原修复液、PBS 缓冲液、TBS 缓冲液等作为抗原修复液。
3．酶修复可选用复合修复液、抗原修复液Ⅰ(与热修复配合使用)、胰蛋白酶、胃蛋白酶消化组织。

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