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- 百奥莱博
- WE0229-HPL
- 北京
- 2025年07月10日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
844
- 英文名：
NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina
- 保质期：
长期
- 供应商：
北京百奥莱博科技有限公司
- 保存条件：
-20℃
特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。
北京百奥莱博专业生产供应二代测序DNA快速建库试剂盒(Illumina平台) 基因结构和功能，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。
名称：二代测序DNA快速建库试剂盒(Illumina平台)
规格：24次|96次
品牌：百奥莱博
产地：国产|进口
编号：WE0229
本试剂盒提供了DNA文库构建所需要的酶预混体系及反应缓冲液，包含除接头与PCR引物外的所有成分，用于illumina二代测序平台DNA文库构建。和一般建库方法相比，该试剂盒操作简单、方便，极大地缩短了文库构建时间。另外，试剂盒采用高保真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可高效制备用于illumina二代测序平台的DNA文库。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性。
试剂盒组成：
| 组份 | 24次 | 96次 |
| End Prep Enzyme Mix | 48μl | 192μl |
| 10x End Repair Reaction Buffer | 200μl | 800μl |
| T4 DNA ligase | 48μl | 192μl |
| T4 DNA ligase Buffer | 400μl | 2×800μl |
| HiFidelity 2×PCRMasterMix | 600μl | 2×1.2ml |
试剂盒特点;
1、末端补平，磷酸化，加A一步完成。
2、不需纯化，直接加接头。
3、超保真扩增，最大程度上降低了扩增偏好性。
4、支持多种样本，且所得文库能够用于Illumina GAIIx，HiSacnSQ、HiSeq 2500/2000/1000和MiSeq sequencing等测序平台的测序。
自备仪器、试剂和耗材：
1、磁力架：建议使用DynaMagTM-2(货号： 12321D)。
2、DNA纯化回收试剂盒：建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(货号： WE0205)。
3、样本接头引物试剂盒：建议使用百奥莱博二代测序多样本接头引物试剂盒 I/II(货号：WE0241/WE0240)。
4、无水乙醇，EB(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)，去离子水(pH 在7.0-8.0之间)。
5、反应管：建议使用低吸附的PCR管与1.5ml离心管；枪头：建议使用高质量过滤枪头防止试剂盒、文库样本污染
实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、避免试剂的反复冻融，建议您首次使用试剂盒后将剩余试剂分装保存。
2、PCR产物因操作不当极易产生污染，导致实验结果不准确，建议将PCR反应体系配制区与PCR产物纯化区隔离，并使用专门的移液器，定时对各实验区域进行清洁。
DNA建库流程示意图：
操作步骤：
样本要求： 5ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB(10 mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中。DNA纯度要求：OD260/OD280=1.8~2.0。
DNA末端修复反应：
1、向200μl PCR管中加入以下试剂：
| 试剂 | 体积 |
| 10×End Repair Reaction Buffer | 6.5μl |
| End Prep Enzyme Mix | 2μl |
| fragmented DNA | X(5ng-1μg) |
| RNase-free Water | Up to 65μl |
2、用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心,使所有组分收集到管底。
3、将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开， 反应程序如下：
15 min @ 12℃
15 min @ 37℃
20 min @ 72℃
Adaptor 连接：
建议使用百奥莱博adaptor进行连接，也可选择使用NEB、illumina公司的adaptor，具体连接方法可参考各公司的产品使用说明书。以下为使用百奥莱博adaptor进行连接的操作步骤：
1、向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入以下试剂：
| 试剂 | 体积 |
| T4 DNA ligase buffer for illumina | 14μl |
| T4 DNA ligase | 2μl |
| Adaptor | 2.5μl |
此时管中溶液总体积为83.5μl。
注意：若起始样本量少于100ng，请将adaptor用去离子水稀释10倍至1.5μM后使用。
2、用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。
3、20℃温浴15分钟。
注意：若此操作使用pcr仪，请将热盖关闭。
DNA片段的选择性回收：
建议使用百奥莱博磁珠法DNA纯化回收试剂盒(WE0205)进行DNA片段选择性回收。
注意：DNA片段选择性回收是可选步骤，若起始样本量低于50ng，不建议进行DNA片段选择性回收，直接进行DNA片段的纯化。另外构建不同大小的DNA文库时，DNA片段选择性回收的磁珠使用量不同，具体磁珠用量可参照附表1(若使用除百奥莱博以外厂家的磁珠，需自行摸索最佳磁珠用量)。
以下操作步骤中，可选择回收DNA片段长度峰值为320bp(插入片段长度200bp)，反应起始体积为100μl。
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、向连接反应液中加入16.5μl去离子水，使adaptor连接反应缓冲液体积至100μl。
注意：若使用NEB adaptor，只需要加入13.5μl去离子水。
3、将上述adaptor反应缓冲液转移至一新的1.5ml离心管中。
4、加入70μl混合均匀的MCPure，涡旋震荡5秒钟后, 室温静置5分钟。
5、短暂离心，将离心管置于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心地将上清溶液转移至新的1.5ml离心管中,并弃去磁珠。
注意：不要弃除上清。
6、向上清中加入25μl混合均匀的MCPure，涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟。
7、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
8、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
9、重复步骤8。
10、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
11、将离心管从磁力架上取下，加入28μl 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)或去离子水(自备)，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
12、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中；
注意：一定不要转移磁珠，微量磁珠污染可影响后续PCR反应的正常进行。
另一种方案： DNA片段的纯化：
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、将adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure，涡旋震荡5秒钟后，室温静置5分钟。
4、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6、重复步骤5。
7、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下，加入28μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
9、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将23μl洗脱液转移至一个新的PCR管中。
附表1：不同片段选择回收时磁珠建议用量
| DNA文库大小 | 插入片段 | 150bp | 200bp | 250bp | 300-400bp | 400-500bp | 500-700bp |
| 插入片段+adaptor | 270bp | 320bp | 400bp | 400-500bp | 500-600bp | 600-800bp | |
| 磁珠用量 | 第一次选择 | 85 | 70 | 55 | 50 | 45 | 35 |
| 第二次选择 | 25 | 25 | 20 | 20 | 20 | 15 |
PCR扩增：
1．在PCR管中加入以下试剂并混匀。
| 试剂 | 体积 |
| 连接adaptor后的DNA片段 | 23μl |
| 2×HiFid elity PCR Mix | 25μl |
| Univesial primer | 1μl |
| Index primer | 1μl |
| 总体积 | 50μl |
2、PCR反应条件：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
| 预变性 | 98℃ | 30 s | |
| 变性 | 98℃ | 10 s | 6-16个循环 |
| 退火 | 65℃ | 30 s | |
| 延伸 | 72℃ | 30 s | |
| 终延伸 | 72℃ | 5 min |
注意：建议1μg样本起始量时PCR循环数为6个循环，50ng时10个循环，5ng时14-15个循环，PCR循环数也可根据实验需要进行优化。
PCR产物的纯化：
1、涡旋振荡MCPure20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2、将PCR反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3、加入1倍样品体积的MCPure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。
4、短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)。小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5、继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80%乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6、重复步骤5。
7、保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8、将离心管从磁力架上取下，加入30μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于洗脱液中，室温静置5分钟。
9、短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将洗脱液转移至一个新的PCR管中约25μl，DNA文库在-20℃保存。
文库质量检测
文库浓度：
为了得到高质量的测序结果，需要对DNA文库进行精确定量，首先推荐使用Real-time PCR方法对DNA文库进行绝对定量。此外，还可使用荧光染料法，如Qubit法或荧光染料picogreen法，此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。最终可使用以下近似公式换算DNA文库的摩尔浓度。
| 文库平均总长度 | 近似转换公式 | 成簇反应DNA文库浓度 |
| 200 bp | 1ng/μl=7.5 nM | 6-12 pM |
| 300 bp | 1ng/μl=5.0 nM | 6-12 pM |
| 400 bp | 1ng/μl=3.8 nM | 6-12 pM |
| 500 bp | 1ng/μl=3.0 nM | 6-12 pM |
文库长度分布
制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100 Bioanalyzer检测DNA文库中的片段长度分布范围。
图1：Agilent 2100 Bioanalyzer文库分析结果
L：DNA Ladder；
S：使用200ng人基因组DNA构建文库，磁珠进行选择回收后结果。
文库结构
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT [Target Sequence] TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
NNNNNN：index, 6bases
储存条件：-20℃
关键词：NGS Fast DNA Library Prep Set for Illumina,WE0229,二代测序DNA快速建库试剂盒(Illumina平台)
除二代测序DNA快速建库试剂盒(Illumina平台) 基因结构和功能外，我公司正在打折促销以下产品：
| 编号 | 名称 |
| WE0109 | Babuddy超保真DNA聚合酶 |
| WE0361 | 生物素标记驴抗小鼠IgG(H+L) |
| WE0174 | 新型植物基因组DNA提取试剂盒 |
| WE0376 | HRP标记山羊抗人IgM(Fc5μ) |
| WE0164 | 高纯质粒大提试剂盒 |
| WE0401 | 组织样本RNA样品保存管 |
| WE0149 | 一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料) |
| WE0211 | 6×UltraStain上样缓冲液 |
| WE0172 | 新型固定组织基因组DNA提取试剂盒 |
| WE0392 | FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L) |
| WE0113 | BaHF高保真DNA聚合酶 |
| WE0378 | 罗丹明标记山羊抗小鼠IgG(H+L) |
| WE0315 | 免疫组化试剂盒(鼠源一抗) |
| WE0276 | BCA蛋白定量试剂盒 |
| WE0371 | 生物素化驴抗人IgG(H+L) |
| WE0321 | 一抗稀释液(WB IHC) |
| WE0198 | 动物组织/细胞RNA提取试剂盒(含DNase I) |
| WE0301 | X光暗盒(12.7cm×17.8cm) |
| WE0144 | 实时荧光定量PCR的预混体系(探针法) |
| WE0302 | 定影粉 |
| WE0238 | T4 DNA聚合酶 |
| WE0375 | HRP标记山羊抗人IgG(H+L) |
| WE0142 | 快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料) |
| WE0320 | 封闭用正常山羊血清工作液(免疫组化封闭液) |
| WE0286 | SDS-PAGE浓缩胶缓冲液(4×) |
| WE0129 | 一步法RT-PCR试剂盒 |
| WE0317 | 水性封片剂 |
| WE0153 | 快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针)(高含量ROX校正染料) |
| WE0191 | TRIzon试剂(总RNA提取) |
| WE0209 | 磁珠法口腔拭子DNA提取试剂盒 |
| WE0272 | Ni琼脂糖凝胶 |
| WE0147 | 一步法Real-Time RT-qPCR试剂盒(荧光探针) |
| WE0223 | RNA酶抑制剂 |
| WE0115 | 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶) |
| WE0282 | 多彩预染蛋白Marker |
| WE0383 | Cy3标记山羊抗小鼠IgG(H+L) |
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