北京T3体外转录试剂盒厂商

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北京百奥莱博科技有限公司专业生产供应北京T3体外转录试剂盒厂商，产品信息：

类别：核酸扩增(PCR)

英文名：T3 in vitro Transcription Kit

产品名	产品编号	包装规格
T3体外转录试剂盒	BTN91108	50次

品牌：百奥莱博

规格：50次

英文名：T3 in vitro Transcription Kit

产地：国产|进口

本试剂盒是基于沙门氏噬菌体T3 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T3启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T3启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

 

产品特点：

1. 即开即用，用户只需提供含T3启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需耍单独准备每一个成份。

2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。

3. 模板DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。

4.可以合成的RNA的最佳长度在20nt到5000nt之问。

5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模板可以合成2-6μg RNA。

6. 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。

 

试剂盒组成：

 

成分	规格
转录预配液(2×)	0.5mL
阳性对照DNA(1.3 Kb片段)	20μL(10ng/μL)
T3 RNA聚合酶混合液	50μL
RNase-free水	1mL
说明书	1份

 

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

 

使用方法：

 

一、制备DNA模板

PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点：

1)必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。

2)是需要转录的DNA序列的上游必须有T3启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T3启动子序列(5´AATTAACCCTCACTAAAGG 3´)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T3启动子的载体，并且克隆位点必须位于T3启动子下游。

3)是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3´突出。如果是3´突出(如选择了Pst I来线性化质粒)，则最好用T4 DNA聚合酶修平。

4)是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。

 

二、体外转录反应

1.在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

 

成分	加入量	备注
DNA模板	xμl	总量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建议用50ng左右；如果模板是质粒DNA，建议用1μg左右；如果用本产品提供的阳性对照，建议用4μL)
转录预配液，2×	10μl	需室温时使用
T3 RNA聚合酶混合液	1μl	本成分还含其他促进剂，所以是混合物
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他体积的反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要定做NTP分开而不是NTP预先混合的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种加帽修饰核苷酸)。

2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。

3. 70℃加热10分钟灭活T3 RNA聚合酶。

4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。

5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

 

若需进一步去除DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。

1.在体外转录结束后，在反应体系中加入3-5U自备的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。

2. 37℃保温15-30分钟。

3. 补水到100μL，

4. 用自备的等体积(100μL)的Tris饱和酚-*仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。

5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(BTN50903；用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。

6. 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。

7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。

8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

 

疑难解答：

1、没有RNA产物。最常见原因是DNA模板有RNase污染，测试方法是用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。

2、RNA产量低。最常见的原因是DNA模板序列。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。

3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6或T7体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6或T7启动子)。

4、RNA长度比预计的长。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。

5、5´单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长(如12小时)，则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T3 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5´端是单磷酸的比例将大大增加。

北京T3体外转录试剂盒厂商专业优质供应商：北京百奥莱博科技有限公司

关键词：BTN91108,T3 in vitro Transcription Kit,T3体外转录试剂盒

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编号	类别	名称
BTN110810	RNA纯化	病毒沉淀剂
BTN100815	工具酶	溶菌酶溶液(10mg/mL)
BTN130560	克隆与表达	大肠杆菌Rosetta-gami (DE3)pLys化学感受态细胞
BTN131272	细胞组织染色	Masson三色染色试剂盒
BTN100805C	RNA纯化	酸酚-*仿-异戊醇混合液(RNA提取用)
BTN160903	核酸扩增(PCR)	可调式易错PCR试剂盒
BTN60201	RNA纯化	非酶DNA清除剂(＞200nt)
BTN50901	克隆与表达	菌落PCR试剂盒2.0
BTN101207	其他生化试剂	1M Tris-HCl(pH8.5)(DNA级)
BTN120627	核酸扩增(PCR)	CTP溶液(100mM)
BTN100810	蛋白质研究	超快蛋白银染试剂盒
BTN70605	核酸电泳和回收	miRNA marker(miRNA电泳分子量标准)
BTN90801B	克隆与表达	一站式TA克隆试剂盒(含感受态细胞)
BTN130675	工具酶	核糖核酸酶HII
BTN130992	DNA纯化	柱式酵母DNA提取试剂盒(玻璃珠法)
BTN131223	其他细胞生物学试剂	Zenker固定液
BTN90708	核酸扩增(PCR)	即用型高保真PCR试剂盒
BTN131087	蛋白质研究	AP标记亲和素
BTN131098	蛋白质研究	生物素化的蛋白G
BTN90315	DNA纯化	非冻型尿液DNA保存液
BTN131208	探针标记及检测	DNA探针变性液
BTN100932	DNA纯化	溶壁酶干粉(破壁酶)
BTN120409	工具酶	BAL 31核酸酶

 

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