大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞 克隆与表达

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞 克隆与表达的品牌：百奥莱博，是优质的克隆与表达产品，用于生化研究，本产品质量好，且极具价格优势，深为用户称道，了解更多大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞等克隆与表达产品请联*(代"系")我司咨询订购。

名称：大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞 克隆与表达
品牌：百奥莱博
规格：0.1mL*10
产地：国产|进口
编号：BTN140431
英文名：E.coli XL10-Gold Chemical Competent Cell
 本产品是采用大肠杆菌XL10菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。本产品适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定复制，还适合非甲基化DNA的转化。使用pUC19质粒检测，本产品转化效率可达108。本感受态细胞具有四环素和*霉素抗性。

菌株基因型：Tetr D(mcrA)183 D(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F- proAB lacIqZDM15 Tn10(Tetr)Amy Camr]

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期半年。

自备试剂：目的DNA、SOC或LB培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μL，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以50μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μL感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3. 42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4. 每个离心管中加入450μL无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。
5. 根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。

注意事项：
1. 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300μL转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4,000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2. 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
3. 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

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SJ0166 D-Raffinose 棉子糖
PY02-261  改良马丁琼脂  250克  
ARB13973 猪脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)血清中含量检测 Porcine adipose triglyceride lipase(atgl)ELISA KIT
CYB163013 羊抗人IgA-RBITC(α链特异)
IPTG(20%,0.8mol/L)   5ml
BTN100937 φ29 DNA聚合酶 φ29 DNA Polymerase
F020231 兔抗绵羊/山羊IgG抗体 Rabbit Anti-Goat IgG
DP119 N96磁珠法质粒DNA小提试剂盒
His标签蛋白纯化填料(带柱子)   10 ml
BL0963 封闭兔血清正常(原液)
ARB11650 人蛋白质二硫键异构酶(PDI)酶标法分析 Human protein disulfide isomerase,pdi ELISA KIT
ARB12596 大鼠基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)elisa检测说明书 Rat tissue inhibitors of metalloproteinase 2,timp-2 ELISA KIT
PY01-104  叶绿素铜*盐  10克  
BTN130694 m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物 RNA Cap Structure Analogs
ARB10131 人N端前脑*素(NT-proBNP)尿液中含量检测 Human n-terminal pro-brain natriuretic Peptide,nt-probnp ELISA KIT
Tris-乙酸电泳缓冲液(50×TAE,RNase free)   500ml
阿魏酸 HDCBS 537-98-4
ARB12419 大鼠细胞周期素D1(CyclIn-D1)Elisa分析 Rat cyclin-d1 ELISA KIT
F040309 小鼠IgG2b抗原 Mouse IgG2b
BL0793 猪IgG抗原(干粉)
大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞 克隆与表达关键词：大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞,E.coli XL10-Gold Chemical Competent Cell,BTN140431


·水样病毒沉淀剂
编号：BTN101118
英文名称：Water Sample Virus Precipitation Reagent
规格：10次

·包涵体大量纯化试剂盒
编号：BTN90510
英文名称：Inclusion Body Maxiprep Kit
规格：2次
本产品是包涵体微量纯化试剂盒的大提升级产品，用于大量，快速的提取高质量的包涵体。

产品特点：
1.大量提取，1次可处理多达5升的菌液，相当于50次中量提取。
2.适合制备级别的包涵体纯化，需在50mL以上的离心管或离心瓶中完成。
3. 能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白在包涵体中所占比重达到60%以上。
4. 即可以选择高压裂解法，也可以采用酶学裂解法裂解细菌。
5. 得到的包涵体可以用于重折叠，也可以用于凝胶层析和动物免疫。

试剂盒组成：

 

成分	规格
溶液A	100mL
溶液B	250mL×2
包涵体溶解液	100ml
溶菌酶	100mg
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存(溶菌酶需要-20℃保存，包涵体溶解液可以室温保存)，有效期一年。

自备试剂：如果得到的重组蛋白确有降解则需要自备蛋白酶抑制剂混合物(BTN80808)。

使用方法：

一．细胞沉淀：
1．转移1-5升菌液到干净的、预称重量的塑料离心瓶中。如果离心瓶体积不够大，可以分多次反复离心收集。
2．5000g(相当于Sorvall GSA转头5500rpm)4℃离心15-30分钟，小心弃上清。
3．复称重量，差值就是细菌的湿重。1升的过夜培养的大肠杆菌湿重一般为3克，所以1-5升菌液一般能得到3-15克细菌。注意：后续操作的很多溶液都是按此步得到得细胞湿重添加。
4．细胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。

二．细胞裂解(下面两法中选其一)：
 高压破碎法(French Press)+超声法(推荐方法)
1．按每克细菌湿重加入3mL溶液A重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌或用Waring捣碎机匀浆(如果细菌湿重超过10克)使细菌悬浮，直到检测不到成块的细胞为止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其终浓度为0.2mg/mL。
2．让细胞通过压力为16000-18000 lb/in2的高压细胞破碎仪，收集的细胞裂解液需放冰上。
3．重复上步操作一次或多次，直到绝大部分细菌都被裂解。注意：每次处理后最好在显微镜下检查细菌裂解的比例。
4．将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理5分钟，工作状态为50%(开0.5秒，关0.5秒)。此过程中最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。
 酶法+超声法(在没有高压破碎仪器时首选方法)
1．按每克细菌湿重加入3mL的含溶菌酶的溶液A重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌细菌沉淀使之悬浮。
2．在细菌悬浮液中加入溶菌酶干粉，使其终浓度为0.2mg/mL，搅拌混匀后37℃放置30分钟裂解细菌，其间不时需要用玻璃棒混匀。细菌释放出的DNA将使裂解物变得十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要继续裂解，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。由于处理量大，最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。
3．将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理5分钟，工作状态为50%(开0.5秒，关0.5秒)。此过程中最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。

三．包涵体纯化：
1．将超声处理的细胞裂解液转移到离心瓶中，22000g 4℃下高速离心60分钟(注意：转子不同其对应的离心速度不同)，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为SDS-PAGE对照样品。
2. 将沉淀(主要由包涵体构成)悬浮在预冷的溶液B中。每克细菌需要5mL溶液B，1升细菌的湿重约3克，大约需要15mL溶液B，用玻璃棒或匀浆器搅拌混匀后室温放置5分钟。
3．22000g 4℃下高速离心30分钟，沉淀将出现三层，最下面的是未彻底破裂的细胞碎片，其上是包涵体，最上层的松软沉淀是细胞壁和细胞外膜。如果处理过程中使用过溶菌酶，则此层较薄。小心收集上清，可以作为包涵体第一次洗涤的对照样品。
4．重复第8-第9步直到上清变清和最上层细胞壁和细胞外膜松软沉淀消失，此过程一般需要重复洗涤2次(共3次洗涤)，小心收集上清作为包涵体第二次洗涤和第三次洗涤的对照样品。本试剂盒提供的溶液B足够一次5升规模的提取洗3次，如需更多溶液B请单独购买。
5．上步得到的沉淀即为包涵体，其中重组蛋白一般占60%重量，其余40%为其他蛋白质。此沉淀可以长期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫动物制备抗体，还可以直接进入下面得包涵体的溶解步骤。
6．估计重组蛋白的产率：首先需要通过预实验知道重组蛋白的表达水品，如果表达水平为1%，则1克湿重的细菌中将含有1mg重组蛋白质。此法得到的重组蛋白质的回收率一般在75%，即1mg重组蛋白质能得到0.75mg，丢失0.25mg。

四．包涵体的溶解：
1．在室温下，将包涵体溶解液加入到包涵体沉淀中，用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果需要将溶解的包涵体直接用于凝胶过滤层析进一步纯化，则按每克原始细胞湿重加入1mL包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为4-5mg/mL；如果需要将溶解的包涵体直接用于蛋白质折叠，则按每克原始细胞湿重加入3mL包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为1-2mg/mL；注意：包涵体溶解液低温放置会产生沉淀，必须45-65℃溶化并混匀后才能使用。
2．室温放置1小时使蛋白质充分溶解。
3．100,000g 4℃离心60分钟(转速需要根据离心机转子的大小换算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。SDS-PAGE检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。
4．将上清(溶解的包涵体)分成10-20mL一份，放于塑料离心管中(不要超过离心管容量的70%)置-80℃长期保存或直接用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的最佳复性条件，需要用户自己摸索。包涵体纯化过程中引入了溶菌酶，在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。


大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞 克隆与表达关键词：大肠杆菌XL10-Gold化学感受态细胞,E.coli XL10-Gold Chemical Competent Cell,BTN140431


·包涵体中量纯化试剂盒
编号：BTN90509
英文名称：Inclusion Body Midiprep Kit
规格：5次
本产品是我们公司包涵体微量纯化试剂盒(BTN90508)的中量提取升级产品，用于中量，快速的提取高质量的包涵体。

产品特点：
1．中量提取，一次可以处理30-50mL的菌液，一次中量提取相当于10-20次微量提取。
2．操作简单快速，整个过程只要四十分钟左右。
3．大规模提取，可以在15-50mL离心管中完成。
4．能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白所占比重达到60%以上。
5．细胞裂解通过非离子洗涤剂的化学裂解法，裂解更加温和。
6．得到的包涵体可以用于重折叠。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	25ml
溶液B	250ml
包涵体溶解液	25mL
溶菌酶	3g
Benzonase(1U/μL)	125μl
说明书	1份

储存条件：常温运输及保存，但溶菌酶和Benzonase需要低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

准备工作：
将3g溶菌酶全部加入到25mL溶液A中溶解，然后根据每次的需要量(一次大量提取需要5mL)分成1mL/只放-20℃待用。每次只取用一管含溶菌酶的溶液A。
包涵体中的重组蛋白一般比溶解状态中的蛋白质更能够抵抗微量内源性蛋白水解酶的降解，如果实验发现得到的重组蛋白确有降解，则需要在溶液A中新鲜加入自备的蛋白酶抑制剂混合物(BTN80808)。

一、细胞裂解和包涵体的纯化：
1．在蛋白诱导期结束时，转移30mL菌液到一个干净的塑料离心管中。
2．5000-7,000rpm室温离心3分钟，小心弃上清。
3．加入5mL含溶菌酶的溶液A重悬细胞。
4．室温放置10-20分钟裂解细菌，其间可以用手轻弹离心管混匀。
5．-20℃冷冻至凝固。凝固有利于裂解细菌，所以一定要凝固到细菌溶液变成固体。
6．室温水浴解冻。如果裂解充分，细菌释放出的DNA将使裂解物十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要重复3-6步，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。如有条件最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。
7．加入25μL的Benzonase(1U/μL)，脱色摇床上摇晃直到裂解液不再粘稠，一般需要30分钟左右(检查方式是将裂解物倾倒转移到另一离心管中，在转移过程中看其是否粘稠)。
8．5000-7,000rpm 4℃离心5分钟，小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为SDS-PAGE对照样品。
9．将沉淀(主要由包涵体构成)悬浮在25mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。
10．5000-7,000rpm 4℃离心10分钟，小心收集上清,可以作为包涵体第一次洗涤的对照样品。
11．将沉淀(主要由包涵体构成)悬浮在25mL的溶液B中，轻柔混匀后室温放置5分钟。
12．5000-7,000rpm 4℃离心10分钟，小心收集上清作为包涵体第二次洗涤的对照样品。一般洗涤两次就能够得到足够纯净的包涵体，如果需要更多洗涤，需要用户单独购买包涵体洗涤液(溶液B)。
13．得到的沉淀即为包涵体，可以长期放置在冰箱待用或直接进入包涵体的溶解步骤。

二、包涵体的溶解：
1．在包涵体沉淀中加入5mL包涵体溶解液，用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果低温放置，包涵体溶解液会产生沉淀，必须45-65℃溶化并混匀后才能使用。
2．室温放置1小时使蛋白质充分溶解。
3．20000g 4℃离心20分钟，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。SDS-PAGE检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。
4．得到的蛋白质溶液可以用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的最佳复性条件，所以本公司不能提供统一的复性溶液，需要用户自己摸索。
 注意：包涵体纯化过程中引入了溶菌酶、DNase和RNase等外源蛋白质，在SDS-PAGE分析时可能有额外条带出现。

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