3´RACE试剂盒优惠促销

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百奥莱博专业生产供应3´RACE试剂盒优惠促销，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：3´RACE试剂盒优惠促销
品牌：百奥莱博
英文名：3´-RACE Kit
规格：10次
编号：BTN101104
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是3´-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其3´-端序列。本试剂盒就是根据3´-RACE原理而开发。RACE的原理如下图：


产品特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2.反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。

试剂盒组成：

 

成分	规格
MMLV逆转录酶-RI混合物(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer(含dNTP)	50μl
PCR MagicMix 2.0(含酶和染料)	1.5ml
3´-RACE引物A(10μM)	10μl
3´-RACE引物B(10μM)	100μl
3´-RACE引物C(10μM)	100μl
RNase-Free水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一、利用含Oligo(dT)的3´-RACE引物A进行逆转录
 注意：MMLV酶使用前必须短暂离心，因为它含50%甘油，及其粘稠，否则将取不到所需体积。
1.在一个PCR管中，加入以下组分：

成分	用量
Poly(A)RNA(或总RNA)	0.2-2μg(5μg)
3´-RACE引物A(10μM)	1μL
MMLV Buffer(含dNTP溶液)	5μL
RNase-Free水	补至19μL
合计	19μL

 注意：如果可能，最好使用Poly(A)RNA作为模板。
  65℃保温5分钟，展开RNA的二级结构，立即冰浴待用。
2. 再在上述PCR管中加入1μl MMLV逆转录酶-RI混合物(200U/μL)。
3. 37℃保温60分钟，42℃保温30分钟进行逆转录反应；然后50℃保温10分钟终止反应。
4. 加入0.5mL RNase-free水稀释上步得到的cDNA，冰浴待用。长期放置需要放-20℃保存。

二、利用基因专一性引物A和3´RACE引物B进行第一轮PCR
5. 用不同量的RT反应液(稀释后的cDNA)设置PCR(样品组最好设置用量梯度，单位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
稀释后的cDNA	1	5	10	15
基因专一性引物A(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
3´RACE引物B(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
98℃ 5分变性RNA-cDNA杂交链，短暂离心后再加入下列成分
PCR MagicMix 2.0	25	25	25	25
RNase-free水	19	15	10	5
合计	50	50	50	50

6. 按下列条件进行PCR(注：应根据实际情况选择适当的退火温度)。
 第1次循环：52-60℃ 2分，72℃ 40分(此步的目地是合成第二链的cDNA，复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)。
 第2-30次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分，72℃ 3分(此步为PCR扩增，复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)。
 最后延伸：72℃ 15分
7. 取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认PCR扩增产物。若得到目的扩增产物需要用于后续实验，请于-20℃保存；若没有得到目的扩增产物，可按下列步骤进行巢式PCR反应。

三、利用基因专一性引物B和3´RACE引物C进行巢式PCR反应
8. 将上轮PCR产物(4管)均用水稀释稀释20倍，然后每管均用巢式PCR进行扩增。巢式PCR反应设置如下：

成分	用量
PCR MagicMix 2.0	25μl
上步得到的PCR反应液(稀释20倍后)	1μl
基因专一性引物B(10μm)	2.5μl
3´RACE引物C(10μm)	2.5μl
超纯水	补至50μL

9. PCR反应。按下列条件进行PCR：
第1-30次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分，72℃ 3分(复性温度需要根据自备基因专一性引物B的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)最后延伸：72℃ 15分
10.电泳检测。然后根据实验结果进行DNA测序或TA克隆。

注意事项：
1. 如果两轮PCR得到的非特异产物多，可以在RT反应是继续降低3´-RACE引物A的用量。
2.自备的基因专一性引物的GC含量最好跟3´-RACE引物B和引物C的一致，后者长度均为18nt，均含11个G(或C)，7个A(或T)。

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·小鼠基因组DNA
编号：BTN131033
英文名称：Mouse Genomic DNA
规格：100μg
本产品为小鼠基因组DNA，是从无疾病小鼠全血中分离到的。利用脉冲电场凝胶电泳测量，90%以上的DNA的大小大于50kb。该DNA适用于Southern blot杂交,基因组分析(包括 PCR)及基因组文库构建等实验。

储存条件：低温运输、4℃保存、有效期一年。

·农杆菌GV3101化学感受态细胞
编号：BTN140384
英文名称：E.coli GV3101 Chemical Competent Cell
规格：10×100μL
 本产品为GV3101农杆菌化学感受态细胞，其具有利福平和庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率高达104cfu/μg。

基因型：C58(rifR)Ti pMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR/strepR)Nopaline。

储存条件：干冰运输、-80℃保存，有效期一年。

自备试剂：质粒DNA、液氮等

使用方法：

转化前准备
1. 冰水浴和37℃水浴。
2.液氮或干冰/乙醇混合物。
3. 将抗性平板在 28℃培养箱中平衡至少15分钟。
转化方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化。
2. 无菌条件下，向刚刚融化的感受态细胞悬液中加入需要转化的质粒，每100μL感受态细胞加1μg质粒DNA，轻柔混匀。冰水浴中静置10分钟。
3. 将离心管置于液氮中速冻 5分钟(注：也可以用干冰和无水乙醇混合物替代液氮)。
4. 迅速将离心管置于37℃水浴静置中5分钟，不要晃动水面。然后快速转至冰水浴中静置5分钟。
5. 加入800μl 无抗生素的2×YT或LB液体培养基，28-30℃振荡培养2~3小时。使菌体复苏，表达抗性。
6. 5000rpm离心1分钟收菌，保留100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，均匀涂布到含有相应抗生素的LB 固体培养基平板上，待平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28-30℃培养48-72小时。
 注：当平板只含有50μg/mL kan时，28℃培养48小时即可；平板中同时加入50μg/mL kan，20μg/mL rif时，需 28℃培养 60h；如果使用的平板含有50μg/mL rif 则需要 28℃培养 72-90小时。

注意事项：
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。
3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 利福平浓度不应高于25μg/μL，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有 50μg/mL kan，若所用平板含有 20μg/mL rif 则转化效率降低到1/2。
5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。
6.相关抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧苄青霉素(carb)	双蒸水溶解	50mg/mL	50μg/mL
硫*(代"酸")卡那霉素(kan)	双蒸水溶解	50mg/mL	50μg/mL
链霉素(strep)	双蒸水溶解	10mg/mL	50μg/mL
利福平(rif)	DMSO溶解	10mg/mL	20μg/mL
庆大霉素(gent)	双蒸水溶解	20mg/mL	40μg/mL

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