重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒

              
1.试剂盒用途
本试剂盒用于体外定量检测待测样品中重组胰蛋白酶含量。本试剂盒仅供研究和工业生产使用。

2.试剂盒基本参数
灵敏度：= 0.049 ng/ml
检测范围：0.078 - 40 ng/ml
特异性：可检测重组胰蛋白酶，与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重复性：板内，板间变异系数均 < 10%。
工作时间：熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。
有效期：6个月

3.试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒，请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。
酶标板和标记抗体（A2）置于-20℃保存，随用随取，切勿室温平衡。

中文名称	规格	保存条件
冻干标准品 (A1)	10ng/支×4支	2-8℃
浓缩标准品 & 样品稀释液 &  HRP-抗体稀释液（25 X）(P1)	1瓶×5 mL	2-8℃
浓缩洗涤液（25 X）(P2)	1瓶×40 mL	2-8℃
底物稀释液（TMB）(P3)	1瓶×15 mL	2-8℃避光
反应终止液 (P4)	1瓶×5 mL	2-8℃
抗体包被的ELISA酶标板（96孔，可拆卸）	8孔×12条	-20℃
浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)	1支×0.05 mL	-20℃
显色底物（TMB）(A3)	5支×0.125 mL	-20℃避光
封板覆膜（可重复使用）	5张
产品说明书	1份
质检报告	1份

说明:
1、所有试剂瓶须旋紧瓶盖以防止蒸发和微生物污染。
2、酶标板-20℃可存放6个月，2-8℃存放勿超过一周。

4.试验所需自备物品
1. 酶标仪（滤光片组波长450 nm，参考波长650nm）
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头、一次性加样槽
3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
4. 洁净无纸屑的吸水纸或干布

5.待测样品注意事项
1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或 -80℃（3个月内检测），避免反复冻融。
2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。
3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
  HRP标记抗体应始终置于-20℃保存，请勿室温平衡，随用随取。
①请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温，观察溶液是否有结晶，如果有结晶按提示进行操作。提前15分钟打开酶标仪预热。
②稀释液配制
将浓缩标准品&样品稀释液&HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释（1：25）。
③洗涤液配制
将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1：25）。
提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。请当日使用。
④标准品配制
将标准品于1000转/分离心1分钟后，加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟后上下温和颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为10 ng/mL）, 然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配置。建议配制成以下浓度：10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、0.312、0.156、0 ng/mL。标准品&样品稀释液直接作为空白孔0 ng/mL。
提示：溶解和稀释标准品过程中尽量避免产生气泡。
倍比稀释方法
取7只EP管，每管加入500 μL标准品&样品稀释液，从10 ng/mL的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL标准品&样品稀释液的EP管中混匀配成5 ng/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
标准品稀释图例（以500 μL为例）

提示：最后一管直接作为空白孔，不再加入标准品工作液。

⑤HRP标记抗体工作液配制 
HRP标记抗体应始终置于-20℃保存，请勿室温平衡，随用随取。实验前请先
将抗体管低速离心，以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量（以100μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度（抗体：稀释液 = 1：250）。当日使用。
⑥TMB显色工作液配制
实验前计算实验所需用量（以100μL /孔计算）。实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟平衡底物和缓冲液，加样前底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度（底物：稀释液 =1：20），现用现配。
注：底物加入显色缓冲液混匀后，若观察显色液变蓝切勿加样，说明可能有污染，请更换洁净器皿。

7.洗涤方法
①自动洗板机：每孔加入洗涤液350 μL， 注入和吸出间隔60秒。
②手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净厚吸水纸（或干布）上拍干，每孔加入洗涤液350 μL（此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗），浸泡5分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。
提示：推荐使用洗瓶冲洗。若使用排枪，加样槽请不要与其他试剂混用，避免污染。

8.操作步骤
①将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100μL。待测样品加入到其他孔，每孔100μL，若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。
提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。浓度由低到高依次加入。
②洗涤：弃去液体，甩干，在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL，浸泡5分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步
骤3次。
③每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL，混匀，酶标板覆膜并置于37℃孵育30分钟。④洗涤：用洗涤液洗板3次，每次洗涤5-10分钟。
⑤每孔加底物显色工作液（TMB）100 μL，酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。
提示：

1. 推荐使用排枪及加样槽加入显色液及终止液，尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。
2. 根据实际显色情况酌情缩短或延长，显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

⑥每孔加终止液50 μL，终止反应，室温放置1分钟。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头切不要接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。
⑦用酶标仪在450 nm波长（参考波长650nm）测量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。
提示: 请提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置检测程序。

9.结果判断
①计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘出标准曲线（作图时亦可去掉空白组的值）。
②推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（请使用Logistic五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线）等。
③若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。
④典型数据
由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

X-浓度（ng/mL）	10	5	2.5	1.25	0.625	0.312	0.156	0
Y-OD450/650 nm	1.601	1.454	1.231	0.872	0.624	0.382	0.244	0.057
Y-OD450/650 nm （去本底）	1.574	1.397	1.174	0.815	0.567	0.325	0.187	0
回收量 （ng/mL）	10.167	4.822	2.628	1.182	0.657	0.306	0.153	—
回收率%	101.7	96.4	105.1	94.6	105.1	98.1	98.1	—

10.注意事项
1.储存：试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染，否则可能会出现错误结果。
酶标板、标记抗体、TMB底物应始终在-20℃保存，随用随取，无需平衡。
2.酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋，按推荐温度存放。
3.加样：加样和加同一试剂时，第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间，从而明显的影响到测量值的准确性及重复性，每次的加样时间最好控制在10分钟之内，推荐设置复孔。
4.温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜，洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。
5.洗板：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸或干布上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪的读数。
6.试剂配制：试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用1000转/分离心一分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示请精确配制。
7.显色时间的控制：加入底物后，请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔五分钟），如梯度已经很明显，请提前加终止液终止反应，以避免颜色过深，影响酶标仪读数。
8.底物：请避光保存底物。在储存和温育时，避免强光直接照射。
9.混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器，使用最低频率，如无微量振荡器，可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
提示：不同批号的试剂盒组分不能混用（洗涤液和终止液除外）。
10.关于样品回收率
1）本试剂盒以测定重组猪胰蛋白酶的抗原性而非活力来推测残留量，因此试剂盒中标准品采用胰蛋白酶的消光系数（E1%1cm=13.6D, 即当A280nm=1.36时，胰蛋白酶浓度为1mg/ml）来计算其蛋白含量，以最大限度保持质控的精确和稳定性。
2）不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中胰蛋白酶的蛋白含量不完全一致，也会造成回收率的差异。
3）为避免上述因素影响，建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法（A280nm）估
算蛋白含量，再稀释至适合的浓度用于回收率测试，尽量减少回收率的误差。

11.问题分析
若实验结果有问题，请及时对显色结果拍照，并妥善保存未使用板条及试剂，然后联系
技术支持。也可参考以下信息以找出原因。

问题描述	可能原因	相应对策
标准曲线梯度差	吸液或加液不准	检查移液器和吸头
	标准品稀释不正确	溶解标准品时稍微旋转瓶身，轻轻混匀使粉末完全溶解
	酶标板洗涤不完全	保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量
显色很弱或无色	温育时间太短	保证充足的温育时间
	实验温度不正确	使用推荐的实验温度
	试剂体积不够或漏加	检查吸液及加液过程，保证所有试剂按顺序足量添加
	稀释不正确
读数数值低	酶标仪设置不正确	在酶标仪上检查波长和滤光片装置
		提前打开酶标仪预热
变异系数大	加液不正确	检查加液情况
背景值高	检测抗体的工作浓度过高	使用推荐的稀释倍数
	酶标板洗涤不完全	重新仔细阅读操作步骤，保证每步清洗完全;如果用自动洗板机，请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。
	洗液有污染	配制新鲜的洗液
灵敏度低	ELISA试剂盒保存不当	按说明书要求保存相关试剂
	读数前未终止	OD读数前应在每孔中加入终止液