重组羧肽酶B酶联免疫吸附测定试剂盒

              
1.试剂盒用途
该试剂盒用于体外定量检测大肠菌液体中重组羧肽酶B含量。本试剂盒仅供研究或工业生产使用。

2.试剂盒基本参数
灵敏度 = 0.203 ng/ml
检测范围：0.25 - 64 ng/ml
特异性：可检测重组羧肽酶B，与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重复性：板内，板间变异系数均 < 10%。
工作时间：熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。
有效期：6个月

3.试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在2-8℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒，请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。
酶标板和标记抗体（A2）置于-20℃保存，随用随取，切勿室温平衡。
 

中文名称	规格	保存条件
冻干标准品 (A1)	32ng/支×4支	2-8℃
浓缩标准品 & 样品稀释液 &  HRP-抗体稀释液（25 X）(P1)	1瓶×5 mL	2-8℃
浓缩洗涤液（25 X）(P2)	1瓶×40 mL	2-8℃
底物稀释液（TMB）(P3)	1瓶×15 mL	2-8℃，避光
反应终止液 (P4)	1瓶×5 mL	2-8℃
抗体包被的ELISA酶标板（96孔，可拆卸）	8孔×12条	-20℃
浓缩辣根过氧化物酶化抗体 (A2)	1支×0.1 mL	-20℃
显色底物（TMB）(A3)	5支×0.125 mL	-20℃，避光
封板覆膜（可重复使用）	5张
产品说明书	1份
质检报告	1份

说明:
1、所有试剂瓶须旋紧瓶盖以防止蒸发和微生物污染。
2、酶标板-20℃可存放6个月，2-8℃存放勿超过一周。

4.试验所需自备物品
1. 酶标仪（滤光片组波长450 nm，参考波长650nm）
2. 高精度移液器，EP管及及一次性吸头、一次性加样槽
3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
4. 洁净无纸屑的吸水纸或干布

5.待测样品注意事项
1、样品收集后若在1周内进行检测的可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或 -80℃（3个月内检测），避免反复冻融。
2、试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。
3、若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
  HRP标记抗体应始终置于-20℃保存，请勿室温平衡，随用随取。
①请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温，观察溶液是否有结晶，如果有结晶按提示进行操作。提前15分钟打开酶标仪预热。
②稀释液配制
将浓缩标准品&样品稀释液 或 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释（1：25）。
③洗涤液配制
将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1：25）。
提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。请当日使用。
④标准品配制
将标准品于1000转/分离心1分钟后，加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟后上下温和颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为32ng/ml）, 然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配置。建议配制成以下浓度：32、 16、 8、 4、 2、 1、0.5 、0ng/ml。标准品&样品稀释液直接作为空白孔0 ng/mL。
提示：溶解和稀释标准品过程中尽量避免产生气泡。
倍比稀释方法 
取7只EP管，每管加入500 μL标准品&样品稀释液，从32 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL标准品&样品稀释液的EP管中混匀配成16 ng/ml的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
标准品稀释图例（以500 μL为例）

提示：最后一管直接作为空白孔，不再加入标准品工作液。

⑤HRP标记抗体工作液配制 
HRP标记抗体应始终置于-20℃保存，请勿室温平衡，随用随取。实验前请先将抗体管低速离心，以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量（以100μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度（抗体：稀释液 = 1：125）。当日使用。
⑥TMB显色工作液配制
实验前计算实验所需用量（以100μL /孔计算）。实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟平衡底物和缓冲液，加样前底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度（底物：稀释液 =1：20），现用现配。
注：底物加入显色缓冲液混匀后，若观察显色液变蓝切勿加样，说明可能有污染，请更换洁净器皿。

7.洗涤方法
①自动洗板机：每孔加入洗涤液350 μL， 注入和吸出间隔60秒。
②手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净厚吸水纸（或干布）上拍干，每孔加入洗涤液350 μL（此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗），浸泡5分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。
提示：推荐使用洗瓶冲洗。若使用排枪，加样槽请不要与其他试剂混用，避免污染。

8.操作步骤
①将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100μL。待测样品加入到其他孔，每孔100μL，若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。
提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。浓度由低到高依次加入。
②洗涤：弃去液体，甩干，在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL，浸泡5分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。
③每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL，混匀，酶标板覆膜并置于37℃孵育30分钟。④洗涤：用洗涤液洗板3次，每次洗涤5-10分钟。
⑤每孔加底物显色工作液（TMB）100 μL，酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。
提示：

1. 推荐使用排枪及加样槽加入显色液及终止液，尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。
2. 根据实际显色情况酌情缩短或延长，显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

⑥每孔加终止液50 μL，终止反应，室温放置1分钟。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头切不要接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。
⑦用酶标仪在450 nm波长（参考波长650nm）测量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。
提示: 请提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置检测程序。

9.结果判断
①计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘出标准曲线（作图时亦可去掉空白组的值）。
②推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（请使用Logistic五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线）等。
③若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。
④典型数据
由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

X-浓度（ng/mL）	32	16	8	4	2	1	0.5	0
Y-OD450/650nm	1.816	1.370	0.801	0.403	0.227	0.150	0.114	0.081
Y-OD450/650nm（去本底）	1.735	1.289	0.720	0.322	0.146	0.069	0.033	0
回收量（ng/mL）	32.02	15.97	8.05	3.92	2.02	1.06	0.54	-
回收率%	100.1	99.8	100.6	98.0	101.0	106.0	108.0	-

 

10.注意事项
1.储存：试剂盒中各种试剂请按说明书提示合理存放。在储存及温育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶需旋紧以防止蒸发和微生物污染，否则可能会出现错误的结果。
酶标板、标记抗体、TMB底物应始终在-20℃保存，随用随取，无需平衡。
2.酶标板：刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。暂时不用板条应拆下后放入备用自封袋，按推荐温度存放。
3.加样：加样和加同一试剂时，第一孔与最后孔之间加样时间间隔过大将导致不同的“预温育”时间，从而明显的影响到测量值的准确性及重复性，每次的加样时间最好控制在10分钟之内。推荐设置复孔。
4.温育：为防止样品蒸发，实验时必须给酶标板覆膜，洗板后应尽快进行下步操作，避免酶标板处于干燥状态。严格遵守给定的温育时间和温度。
5.洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在吸水纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。在读数前要清除酶标板底部残留的液体和手指印，以免影响酶标仪读数。
6.试剂配制：试剂盒在运输过程中会使液体沾到管壁或瓶盖，因此使用1000转/分离心一分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前请用移液器小心吹打4-5次，使溶液混匀。所有试剂请按说明书指示请精确配制。
7.显色时间的控制：加入底物后，请定时观察反应孔的颜色变化（比如每隔五分钟），如梯度已经很明显，请提前加终止液终止反应，以避免颜色过深，影响酶标仪读数。
8.底物：请避光保存底物。在储存和温育时，避免强光直接照射。
9.混匀：充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器，使用最低频率，如无微量振荡器，可以在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
提示：不同批号的试剂盒组分不能混用（洗涤液和终止液除外）。
10.关于样品回收率
1）本试剂盒以测定重组羧肽酶B的抗原性而非活力来推测残留量，因此试剂盒中标准品采用羧肽酶B的消光系数（E1%1cm=21.0D, 即当A280nm=2.10时，羧肽酶B浓度为1mg/ml）来计算其蛋白含量，以最大限度保持质控的精确和稳定性。
2）不同计量方法以及产品纯度的差别可以导致不同来源、不同批次产品中羧肽酶B的蛋白含量不完全一致，也会造成回收率的差异。
3）为避免上述因素影响，建议将用作回收率测试的样品采用分光光度法（A280nm）估算蛋白含量，再稀释至适合的浓度用于回收率测试，尽量减少回收率的误差。 若实验结果有问题，请及时对显色结果拍照，并妥善保存未使用板条及试剂，然后联系技术支持。也可参考以下信息找出原因。

问题描述	可能原因	相应对策
标准曲线梯度差	吸液或加液不准	检查移液器和吸头
	标准品稀释不正确	溶解标准品时稍微旋转瓶身，轻轻混匀使粉末完全溶解
	洗涤不完全	保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量
显色很弱或无色	温育时间太短	保证充足的温育时间
	实验温度不正确	使用推荐的实验温度
	试剂体积不够或漏加	检查吸液及加液过程，保证所有试剂按顺序足量添加
	稀释不正确
读数数值低	酶标仪设置不正确	在酶标仪上检查波长和滤光片装置
		提前打开酶标仪预热
变异系数大	加液不正确	检查加液情况
背景值高	检测抗体的工作浓度过高	使用推荐的稀释倍数
	酶标板洗涤不完全	重新仔细阅读操作步骤，保证每步清洗完全;如果用自动洗板机，请检查所有的出口是否有堵塞;是否使用试剂盒配备的洗涤液。
	洗液有污染	配制新鲜的洗液
灵敏度低	ELZSA试剂盒保存不当	按说明书要求保存相关试剂
	读数前未终止	OD读数前应在每孔中加入终止液