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RNAtiqu Circulating RNA Extraction Reagent
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北京百奥莱博科技有限公司
特别声明:本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品,严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。
北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域,致力于为客户提供包括血清血浆尿液游离RNA提取试剂 RNA纯化在内的一系列分子生物学试剂产品,并提供一系列相关的技术服务。
名称:血清血浆尿液游离RNA提取试剂 RNA纯化
品牌:百奥莱博
英文名:RNAtiqu Circulating RNA Extraction Reagent
规格:50ml
本品特别适用于从血清、血浆中分离纯化包括microRNA和其他小RNA(<200nt)在内的总RNA。本品灵活处理不同起始量的样品,在有效裂解样本的同时,可有效保存RNA的完整性,提取的总RNA完整性好,无蛋白和DNA污染,提取的RNA可用于RT-PCR、Northern Blot和分子克隆等下游实验。
自备试剂:*仿、异丙醇、75%乙醇、无RNase的水(新开封或提取RNA专用)。
实验前准备及重要注意事项/strong>:
1、预防RNase污染,应注意以下几方面:
① 使用无RNase的塑料制品和枪头,避免交叉污染。
② 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底冲洗后高压灭菌。
③ 配制溶液应使用无RNase的水。
④ 操作人员戴一次性口罩和手套,实验过程中要勤换手套。
2、提取的样品避免反复冻融,否则影响RNA提取得率和质量。
3、本品中含有*酚,具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品,如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛,应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。
4、样品用游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂匀浆后,如不即刻加入*仿,置于-70℃可放置一个月以上。
5、保存在75%乙醇中的RNA沉淀,2~8℃可以保存一周,-20℃条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短,容易降解,建议提取后尽快进行后续实验,如反转录成cDNA,Northern Blot等。
6、若下游实验对DNA非常敏感,建议用不含RNase的DNase I(货号:WE0213)对RNA进行处理。
操作步骤:
1、取200μl新鲜或者冻存的血清或血浆,加入3倍体积的游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂。振荡30秒,充分混匀。
注意:样本加入游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂后,可能会出现沉淀,经过振荡混匀后,沉淀基本消失。若仍有少量沉淀,不影响下游实验,可继续操作。
2、将处理后的样品在室温放置5分钟,使蛋白核酸复合物完全分离。
3、向以上溶液中加入*仿,每使用1ml血清/血浆样本专用总RNA提取试剂加入0.2ml*仿,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置2-3分钟。
注意:如不能涡旋混匀,可手动快速颠倒混匀2分钟。
4、4℃ 12000rpm离心20分钟,此时样品分成三层:红色有机相,中间层和上层无色水相,RNA 主要在水相中,把水相转移到一个新的无RNase的离心管(自备)中。
5、在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置30分钟。或-20℃沉淀过夜,效果更佳。
6、4℃ 12000rpm 离心20分钟,弃上清。
注意:离心前RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
7、加入75%乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂加入1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
8、4℃ 12000rpm离心3分钟,小心吸弃上清,注意不要吸弃RNA沉淀。
注意:剩余的少量液体可短暂离心,然后用枪头吸出,注意不要吸弃沉淀。
9、室温放置2-3分钟,晾干。加入30-100μl无RNase的水,充分溶解RNA,得到的RNA保存在-70℃,防止降解。
注意:沉淀不要过分干燥,以免难于溶解。
储存条件:2~8℃。
更多有关血清血浆尿液游离RNA提取试剂 RNA纯化的价格及使用说明等,请联系我们的业务经理王欣女士咨询,我公司还销*(代"售")以下产品:
·RNase A溶液(100mg/ml)
编号:WE0225
英文名称:RNase A(100mg/ml)
规格:1ml
·Protein A+G琼脂糖凝胶
编号:WE0268
英文名称:Protein A+G Agarose
规格:1ml
本产品为Protein A和Protein G 共价交联到Agarose beads上的产物,并保存在20%乙醇溶液中。本产品包含1ml protein A+G agarose和1ml 20%乙醇溶液,即为50%悬浮介质。主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)。免疫沉淀抗体包括Mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA,Rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c,Rabbit IgG,Rabbit and Goat polyclonal Abs,以及Human IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。本产品也可以用于抗体的纯化。
注意事项:
1、本产品保存在2~8℃ 20%的乙醇中,从低温取出后恢复到室温后装柱,避免产生气泡影响柱效。
2、使用前请充分颠倒若干次使混合均匀。
使用方法:
I 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP):
1、蛋白样品的准备:
a. 对于细胞样品,用1×PBS洗涤一次。2×106细胞加入200μl细胞裂解液,以此类推。
b. 对于组织样品约20 mg加入200μl组织蛋白抽提试剂,以此类推。
注:如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释;如果蛋白样品浓度过低,可适当减少裂解液的用量。
2、取约200μg至1 mg蛋白样品,与0.2μg至2μg纯化后的抗体混合,4℃缓慢摇动过夜。
3、取20-40μl充分重悬的Protein A+G Agarose加入到一支新的1.5ml离心管中,短暂离心,小心吸弃上清。
4、加入500μl 1×PBS洗涤Protein A+G Agarose,短暂离心,小心吸弃上清。重复此步骤2次。
5、将步骤2的抗原抗体复合物加入到洗涤后的Protein A+G Agarose中,4℃孵育1-3个小时,短暂离心,小心吸弃上清。
6、加入500μl 1×PBS洗涤,短暂离心,小心吸弃上清。重复此步骤2次。
7、向沉淀中加入20-40μl 2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液,涡旋重悬沉淀,短暂离心把样品离心至
8、蛋白煮沸变性5分钟,短暂离心后取部分或全部上清,用于SDS-PAGE电泳或Western Blot等。暂时不用的样品可在-20℃保存。
II 免疫共沉淀(CO-IP):
参考免疫沉淀的方法进行,但免疫共沉淀(CO-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但以用新鲜的蛋白样品为佳。
储存条件:2~8℃,避免冻存。
血清血浆尿液游离RNA提取试剂 RNA纯化关键词:WE0201,血清血浆尿液游离RNA提取试剂,RNAtiqu Circulating RNA Extraction Reagent
·30%丙*(代"烯")酰胺-甲叉双丙*(代"烯")酰胺溶液(29:1)
编号:WE0291
英文名称:30% Acr-Bis(29:1)
规格:2×250ml
30%Acr-Bis(29:1)即30%的聚丙*(代"烯")酰胺-N,N"-亚甲双丙*(代"烯")酰胺(Acrylamide-N,N"-Methylene*(代"b")isacrylamide)的水溶液,其中Acrylamide与-N,N"-Methylene*(代"b")isacrylamide 的比例为29:1。本产品常用于配制各种浓度的变性及非变性聚丙*(代"烯")酰胺(PAGE)凝胶,进行常规的蛋白或核酸电泳实验,使用方便。
操作步骤:
根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度,最佳胶浓度请参考附表1。
I 灌制分离胶(各试剂使用量请参考附表2)
1、参照凝胶模具说明书,装配好凝胶模具。
注:加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触,是否加入上层筛板可根据实际情况选择。
2、将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和纯水在小烧杯或试管中混合。
3、加入10%APS和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
4、在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液(对于mini-gel,凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可), 然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1 cm的水层,使凝胶表面保持平整。
5、静置30-60分钟,待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后,表面凝胶已聚合。
II 灌制浓缩胶(各试剂使用量请参考附表3)
1、去除覆盖在分离胶上的水层。
2、将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、浓缩胶缓冲液和纯水在一个小烧杯或试管中混合。
3、加入10%过硫*(代"酸")铵和TEMED,轻轻搅拌使其混匀,避免产生气泡。
4、将浓缩胶溶液加至分离胶的上面,直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
5、将梳子插入凝胶内,避免产生气泡。
6、静置10~20分钟,等待浓缩胶聚合。
7、待凝胶聚合后,小心地拔出梳子,以免破坏加样孔。
8、进行常规电泳操作。
附表1. SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围
SDS-PAGE 分离胶浓度 | 最佳分离范围 |
6%胶 | 50-150 kD |
8%胶 | 30-90 kD |
10%胶 | 20-80 kD |
12%胶 | 12-60 kD |
15%胶 | 10-40 kD |
分离胶浓度 | 凝胶体积 | 所需各组分体积(单位:ml) | ||||
纯水 | 30%Acr-Bis(29:1) | SDS-PAGE Separating Gel Buffer(4×) |
10%APS | TEMED | ||
6% | 5ml | 2.75 | 1.0 | 1.25 | 0.05 | 0.004 |
10ml | 5.5 | 2.0 | 2.5 | 0.1 | 0.008 | |
15ml | 8.25 | 3.0 | 3.75 | 0.15 | 0.012 | |
20ml | 11 | 4.0 | 5 | 0.2 | 0.016 | |
8% | 5ml | 2.42 | 1.33 | 1.25 | 0.05 | 0.003 |
10ml | 4.8 | 2.7 | 2.5 | 0.1 | 0.006 | |
15ml | 7.25 | 4.0 | 3.75 | 0.15 | 0.009 | |
20ml | 9.7 | 5.3 | 5 | 0.2 | 0.012 | |
10% | 5ml | 2.08 | 1.67 | 1.25 | 0.05 | 0.002 |
10ml | 4.17 | 3.33 | 2.5 | 0.1 | 0.004 | |
15ml | 6.25 | 5.0 | 3.75 | 0.15 | 0.006 | |
20ml | 8.3 | 6.7 | 5 | 0.2 | 0.008 | |
12% | 5ml | 1.75 | 2.0 | 1.25 | 0.05 | 0.002 |
10ml | 3.5 | 4.0 | 2.5 | 0.1 | 0.004 | |
15ml | 5.25 | 6.0 | 3.75 | 0.15 | 0.006 | |
20ml | 7.0 | 8.0 | 5 | 0.2 | 0.008 | |
15% | 5ml | 1.25 | 2.5 | 1.25 | 0.05 | 0.002 |
10ml | 2.5 | 5.0 | 2.5 | 0.1 | 0.004 | |
15ml | 3.75 | 7.5 | 3.75 | 0.15 | 0.006 | |
20ml | 5 | 10.0 | 5 | 0.2 | 0.008 |
凝胶体积 | 所需各组分体积(单位:ml) | ||||
纯水 | 30%Acr-Bis(29:1) | SDS-PAGE Stacking Gel Buffer(4×) |
10%APS | TEMED | |
2ml | 1.14 | 0.34 | 0.5 | 0.02 | 0.002 |
4ml | 2.28 | 0.68 | 1 | 0.04 | 0.004 |
6ml | 3.42 | 1.02 | 1.5 | 0.06 | 0.006 |
8ml | 4.56 | 1.36 | 2 | 0.08 | 0.008 |
组份 | 1ml | 5ml |
2×SuperSYBR Mixture(High ROX) | 1ml | 5×1ml |
ddH2O | 1ml | 5×1ml |
试剂 | 50μl反应体系 | 终浓度 |
2×SuperSYBR Mixture(High ROX) | 2 5μl | 1× |
Forward Primer,10μM | 1μl | 0.2μM |
Reverse Primer,10μM | 1μl | 0.2μM |
Template DNA | 2μl | |
ddH2O | up to 50μl |
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 10 min | |
变性 | 95℃ | 15 s | 35-40 个循环 |
退火/延伸 | 60℃ | 1 min | |
融解曲线分析 | 95℃ | 15 s | |
60℃ | 1 min | ||
95℃ | 15 s | ||
60℃ | 15 s |
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 10 min | |
变性 | 95℃ | 10 s | 35-40个循环 |
退火 | 56-64℃ | 30s | |
延伸 | 72℃ | 32s | |
融解曲线分析 | 95℃ | 15s | |
60℃ | 1 min | ||
95℃ | 15 s | ||
60℃ | 15 s |
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