北京第一链cDNA Synthesis Super Mix

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括北京第一链cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR厂家在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：北京第一链cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR厂家
英文名：First Strand cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
规格：200T
编号：SY0291
本试剂盒基于Reverse Transcriptase，该酶热稳定性提高，在50℃的半衰期超过240min，且可长时间耐受高达55℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录，能稳定可靠地合成cDNA。且Reverse Transcriptase的独特设计，进一步增强了模板亲和力和行进性，使得全长cDNA的合成能力有了大幅度提升，可获得长达20 kb的cDNA，并且对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度，非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。

本试剂盒包含由总RNA或mRNA合成高质量第一条链cDNA所需的所有成分，并提供两种cDNA合成引物：Random hexamers和oligo（dT）18。合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR、qPCR以及PCR克隆。其中，5×RT Mix包含优化的缓冲体系和dNTP； Enzyme Mix包含Reverse Transcriptase和RNase inhibitor。可根据需要，选择Oligo (dT)18、Random hexamers或基因特异引物作为逆转录引物。

产品组份：
RNase free ddH2O————1 ml
5×RT Mix————200 μl
Enzyme Mix*————50 μl
Oligo dT18 (0.5 μg/μl)————50 μl
Random hexamers (N6)————50 μl
* 包含RNase inhibitor，用于抵抗环境和体系中可能存在的痕量的RNase。

质量控制

所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶、RNase残留。
功能检测1：以500 ng mouse total RNA为模板，Oligo dT18为引物，50℃反应45分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增ne*(代"b")ulin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的20.0 kb条带。
功能检测2：以100 pg Hela cell total RNA为模板，Oligo dT18为引物，50℃反应30分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。
功能检测3：以500 ng Hela cell total RNA为模板，Oligo dT18为引物，55℃反应45分钟。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。
功能检测4：以1 pg-1 µg HeLa cell total RNA为模板，以Oligo dT18和Random hexamers为引物，测试qRT-PCR性能。

储存条件：-20℃，有效期12个月。

更多有关北京第一链cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR厂家的价格及使用说明等，请联*(代"系")我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：

·小鼠抗GAPDH单克隆抗体
编号：SY0635
英文名称：GAPDH, Mouse mAb
规格：20μl(＞50次)
本品为小鼠抗GAPDH单克隆抗体，小鼠抗磷酸甘油醛脱*酶单克隆抗体。推荐稀释倍数：ELISA（1:50000～1:100000），WB（1:10000），IHC（1:500～1:1000），IF（1:500～1:1000）

GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，即磷酸甘油醛脱*酶，可催化甘油醛-3-磷酸向1,3双磷酸甘油酸的转化，是糖酵解的关键酶之一。

GAPDH几乎在所有组织和细胞中都高水平表达，且作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此，在Western blot检测中，被广泛的用作蛋白质标准化内参。

产品类型：小鼠单克隆抗体（Mouse monoclonal, mAb）IgG，内参抗体
反应性：Human, Mouse, Rabbit, Frog, Fish, Chicken, Rat
宿主：Mouse
应用：ELISA/WB/IHC/IF
检测分子量（Molecular Wt.）：～36kDa
储存缓冲液： 1 mg/ml in Phosphate buffered saline (PBS) with 15 mM sodiu*(代"m") azide, pH 7.2
纯化方式：亲和纯化
纯度：＞95%（SDS-PAGE）

储存条件：-20℃，避免反复冻融。


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·考马斯亮蓝快速染色液(8分钟)
编号：SY0345
英文名称：Commassie blue fast stain solution (8 mins)
规格：1L
实验室常使用考马斯亮蓝染色法对凝胶上分离的蛋白进行染色，它既克服了*基黑染色灵敏度不高的限制，又比银染简便易操作。目前广泛用的考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用于蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

本品是基于考马斯亮蓝染色法对蛋白质进行染色而设计的，与传统染色液相比，本品为新型PAGE胶染色试剂，不含甲醇，醋酸等有毒或有刺激性物质，其独特配方使得表面活性剂剥离，蛋白固定，蛋白染色，非蛋白区域着色屏蔽等功能同时进行。8-10分钟即可完成page胶上蛋白染色，无需脱色。染色分辨率与传统染色方法分辨率相当。染色的蛋白带或蛋白点可进行高效电洗脱，适用于蛋白质谱分析。

储存条件：室温，有效期一年。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并带一次性手套操作。
2）用本产品4分钟即可显示出蛋白条带，加长染色时间和增加染色次数，有利于提高染色灵敏度。
3）如果凝胶面积增大或者厚度增加，增加染色液和染色时间。
4）切忌长时间高功率加热，否则会使溶液连续沸腾蒸发，造成凝胶干裂。如果不慎使凝胶干裂，可加入 50ml去离子水，高火加热1min，低火加热3-5min，可一定程度恢复干裂的PAGE胶，但染色效果有一定毁坏。

操作步骤

1. 染色工作液的配制
本品是以125×浓缩液的形式提供的，每瓶8ml。
使用前只需要取一瓶8ml的染色原液用去离子水或者蒸馏水稀释到1L，混匀后即为染色工作液，室温保存即可。

2. 染色步骤
1）剥下电泳完毕的SDS-PAGE，或native-PAGE胶，（约10×10cm，厚度小于1mm），放在比凝胶稍大的可微波炉加热的带盖塑料盒中（注意：一定要有盖以防止水汽蒸发过度）；
2） 加入50ml染色液，放入微波炉里先用高火（微波炉最大“火”）加热1分钟，取出染胶盒放在水平摇床上，中速震荡3-5min。倒掉染色液。
3）再加入50ml新的染色液高火加热1分钟，接着用低火（微波上最小“火”）加热染色3-8min。
4）倒去染色液，用清水冲洗掉残余染色液即可观察或拍照，若在旋转摇床上用清水漂洗若干次，可将残余的微弱背景彻底去除。

染色效果图



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·His标签蛋白琼脂糖高速纯化树脂
编号：SY0393
英文名称：Ni-NTA Agarose Resin 6FF
规格：10ml
Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性（可耐受最高0.3 MPa的压力），该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。

基质（Matrix）：高度交联的6%琼脂糖凝胶
孔径（Bead size）：45-165µm
载量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压（Tolerance Pressuremax）：0.3MPa, 3bar
储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS
储存条件：4℃保存，有效期2年

使用方法

（一）纯化流程
1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤除菌。可溶性组*酸标签蛋白纯化所需配方详见附表2。包涵体组*酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表3。

2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）
1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液至离心管中，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组*酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组*酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：对于大量体积的上清，需加入硫*(代"酸")铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）
1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。
4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。
5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3 装柱
1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。
2）将树脂悬浮，小心地将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。
3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。
4）打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如达不到推荐的压力或流速，可以用所用泵的最大流速，这样也可以达到一个较好的装填效果。当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱体积的去离子水。标上柱床高度。【注】：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%。
5）关闭泵，关闭层析柱出口。
6）如使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。
7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。
8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如需要可重新调整分配器。

4 样品纯化
装柱后，可用各种常规的中压色谱系统，以AKTA使用为例进行说明：
1）将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，打开下出口，将纯化柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
2）3-5倍柱体积去离子水冲洗纯化柱。
3）至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。1ml规格预装柱推荐流速为1ml/min，5ml预装柱推荐流速为5ml/min。
4）利用泵或注射器上样，收集流出液，以便SDS-PAGE检测蛋白结合情况。【注】：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。
【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
7）建议用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

5 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa），填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：
1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；
2）去离子水清洗5倍柱体积；
3）2%SDS清洗3倍柱体积；
4）去离子水清洗5倍柱体积；
5）乙醇清洗5倍柱体积；
6）去离子水清洗5倍柱体积；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；
8）去离子水清洗5倍柱体积；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；
10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

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