北京现货柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)哪里卖

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百奥莱博专业生产供应北京现货柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)哪里卖，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：北京现货柱式动物线粒体DNA提取试剂盒(测序级)哪里卖
规格：15次
品牌：百奥莱博
英文名：Animal mitochondrial DNA column extraction kit(Sequencing Grade)
编号：BTN120501
产地：国产|进口
本试剂盒就是基于先纯化动物细胞线粒体、再从中柱式法纯化其DNA的两步法试剂盒。

试剂盒特点：
1. 即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2. 两步法，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，有粗提(mtDNA纯化前不用DNase处理线粒体)和精提(mtDNA纯化前用DNase处理线粒体)两套操作方案，适合于各种要求不同的后续实验。
3. 本产品一次可以处理约107×108个培养细胞，10mg培养细胞(相当于5瓶150 mm培养细胞)可以纯化到到0.2-0.5mg线粒体。
4. 本产品适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。
5. 提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

试剂盒组成：

 

成分	规格	备注
溶液A	225ml	配制匀浆液
蔗糖	25.4g	配制匀浆液
詹纳斯染色液	1ml	染色线粒体
溶液B	0.5ml	配制核酸酶反应液
DNase A干粉	1mg	酶切细胞核DNA
Benzonase(1U/μL)	100μl	酶切细胞核DNA
溶液C	10ml	纯化mtDNA
溶液D	5ml	纯化mtDNA
溶液E	20ml	纯化mtDNA
离心吸附柱	15套	纯化mtDNA
通用洗柱液	15ml	纯化mtDNA
DNA洗脱液	10ml	纯化mtDNA
人TPMT VNTR	上游引物	GCT CCG CCC TGC CCA TTT
	下游引物	GCC TCC GCC ACC AAT GAC
人线粒体HV2区	上游引物	GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C
	下游引物	CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存，保存期限一年。

使用方法：
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，所要用到的溶液和离心管都必须预先冷却，否则线粒体容易破裂。

一：线粒体粗提
1. 称25.4g蔗糖到225mL溶液A中，盖上盖子后充分摇晃3～5分钟溶解即得250mL溶液A工作液，放冰上预冷待用。未用完的溶液A工作液需要-20℃保存，否则会长菌。
2. 如果是单层细胞，先用20mL PBS缓冲液洗涤107×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集107×108个细胞，再用20mL PBS缓冲液洗涤2次，最后将细胞重悬在20mL PBS缓冲液中。
3. 用平甩转子(swinging-bucket rotor)离心机1000 g 4℃离心10分钟，吸弃上清，保留细胞沉淀。
4. 加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的溶液A工作液，轻柔重悬细胞。
5. 如果是成纤维细胞，由于其难于裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是，则直接进入下步操作。
6. 将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中(工作体积为10-15mL，间隙为0.12 mm，最好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低)匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3μl匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20-50%以下为佳。
7. 用平甩转子离心机4℃ 1000 g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
8.转移上清液到离心管中，冰上放置待用。如有必要，可在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴一滴上清液到载玻片上，再滴入50μl詹纳斯染液染色20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
9. 用固定角度转子(fixed-angle rotor)离心机4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
10. 用5mL溶液A工作液洗涤2次得线粒体粗提液(即重悬后，4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清)。
11. 如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第3部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。
12. 如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。

二：线粒体粗提液中细胞核DNA的去除及鉴定
13. 将线粒体重悬于0.3mL溶液A工作液中，取10μl作为未处理对照。
14. 加入6μl Benzonase(1U/μL)溶液和30μl DNase A溶液(配法：将0.5mL溶液B加到装有1mg DNase A干粉的离心管中得到2mg/mL溶液，未用完的部分需要分装后放-20℃保存)。
15. 37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：最好先预实验，每隔一段时间取10μl样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增1-4个自选的VNTR位点和1-2个mtDNA基因(如vis或COII基因)，检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为最佳。可从本公司另购细胞核基因和线粒体基因专一性引物。
16. 加入10μl自备的0.5M EDTA溶液(pH8.0)以终止酶反应。显微镜下检查线粒体完整性(见上节第8步)。
17. 用固定角度转子离心机4℃10000 g离心10分钟，弃上清。
18. 用1mL的溶液A工作液洗涤沉淀(即重悬后，4℃ 10000 g离心10分钟，弃上清。此为一次洗涤。)2次得到线粒体沉淀。

三：线粒体DNA提取
19.在不超过100μl的线粒体沉淀中加入600μl预热的溶液C到沉淀中，充分吹打均匀。
20. 再加入150μl(可称150-160mg)预热的溶液D到离心管中，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。
21. 65℃放置3～5分钟。
22. 加入200μl自备*仿，震荡混匀10-30秒，此时溶液将呈乳白色。
23. 12000～15000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间的白膜。
24. 加入1.5倍体积的溶液E，颠倒混匀后全部转移到离心吸附柱中，室温放置至少2分钟。
25. 12000rpm室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。
26. 通用洗柱液洗涤2次(将0.5mL加入离心柱中，12000rpm室温离心1分钟，弃穿透液，此为洗涤一次，再重复一次)。
27. 空甩半分钟去除残留液体,将离心吸附柱转移到新的1.5mL离心管中。
28. 加30-50μl DNA 洗脱液，室温放置3～5分钟。
29. 12000rpm室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液。

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·3´RACE试剂盒
编号：BTN101104
英文名称：3´-RACE Kit
规格：10次
研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方法是3´-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其3´-端序列。本试剂盒就是根据3´-RACE原理而开发。RACE的原理如下图：


产品特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2.反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。

试剂盒组成：

成分	规格
MMLV逆转录酶-RI混合物(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer(含dNTP)	50μl
PCR MagicMix 2.0(含酶和染料)	1.5ml
3´-RACE引物A(10μM)	10μl
3´-RACE引物B(10μM)	100μl
3´-RACE引物C(10μM)	100μl
RNase-Free水	1ml
说明书	1份

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

一、利用含Oligo(dT)的3´-RACE引物A进行逆转录
 注意：MMLV酶使用前必须短暂离心，因为它含50%甘油，及其粘稠，否则将取不到所需体积。
1.在一个PCR管中，加入以下组分：

成分	用量
Poly(A)RNA(或总RNA)	0.2-2μg(5μg)
3´-RACE引物A(10μM)	1μL
MMLV Buffer(含dNTP溶液)	5μL
RNase-Free水	补至19μL
合计	19μL

 注意：如果可能，最好使用Poly(A)RNA作为模板。
  65℃保温5分钟，展开RNA的二级结构，立即冰浴待用。
2. 再在上述PCR管中加入1μl MMLV逆转录酶-RI混合物(200U/μL)。
3. 37℃保温60分钟，42℃保温30分钟进行逆转录反应；然后50℃保温10分钟终止反应。
4. 加入0.5mL RNase-free水稀释上步得到的cDNA，冰浴待用。长期放置需要放-20℃保存。

二、利用基因专一性引物A和3´RACE引物B进行第一轮PCR
5. 用不同量的RT反应液(稀释后的cDNA)设置PCR(样品组最好设置用量梯度，单位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
稀释后的cDNA	1	5	10	15
基因专一性引物A(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
3´RACE引物B(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
98℃ 5分变性RNA-cDNA杂交链，短暂离心后再加入下列成分
PCR MagicMix 2.0	25	25	25	25
RNase-free水	19	15	10	5
合计	50	50	50	50

6. 按下列条件进行PCR(注：应根据实际情况选择适当的退火温度)。
 第1次循环：52-60℃ 2分，72℃ 40分(此步的目地是合成第二链的cDNA，复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)。
 第2-30次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分，72℃ 3分(此步为PCR扩增，复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)。
 最后延伸：72℃ 15分
7. 取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认PCR扩增产物。若得到目的扩增产物需要用于后续实验，请于-20℃保存；若没有得到目的扩增产物，可按下列步骤进行巢式PCR反应。

三、利用基因专一性引物B和3´RACE引物C进行巢式PCR反应
8. 将上轮PCR产物(4管)均用水稀释稀释20倍，然后每管均用巢式PCR进行扩增。巢式PCR反应设置如下：

成分	用量
PCR MagicMix 2.0	25μl
上步得到的PCR反应液(稀释20倍后)	1μl
基因专一性引物B(10μm)	2.5μl
3´RACE引物C(10μm)	2.5μl
超纯水	补至50μL

9. PCR反应。按下列条件进行PCR：
第1-30次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分，72℃ 3分(复性温度需要根据自备基因专一性引物B的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)最后延伸：72℃ 15分
10.电泳检测。然后根据实验结果进行DNA测序或TA克隆。

注意事项：
1. 如果两轮PCR得到的非特异产物多，可以在RT反应是继续降低3´-RACE引物A的用量。
2.自备的基因专一性引物的GC含量最好跟3´-RACE引物B和引物C的一致，后者长度均为18nt，均含11个G(或C)，7个A(或T)。


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