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文献和实验Protein Expression and Purification of RPA70-AB (181-422)
Comments: pSV281 RPA70AB Constructed by L.Mizoue; May '02.This plasmid encodes RPA 70 subunit residues 181-422 as a fusion protein with an NT 6His tag.The tag can be cleaved off with TEV protease (recognition site is ENLFYQG)leaving "GS" at NT
，并且 EST12-RACK1 诱导的细胞焦亡在 M.tb 诱导的免疫中起关键作用。 研究内容： 1、RD 区编码蛋白筛选：对 40 种 RD 区（RD1-3、11-14）重组蛋白进行筛选（巨噬细胞焦磷酸相关蛋白），通过 LDH 释放实验细胞毒性分析，发现 EST12 对巨噬细胞有显著焦解作用。 2、菌株构建：构建 M. tb H37Rv ΔEST12（Rv1579c 敲除菌株）、BCG-EST12（Rv1579c 过表达菌株）、M. smeg–EST12（Rv1579c 过表达菌株）。 3、小鼠基因
，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备: ①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。 ②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。 ③然后立即混旋，室温下静置30分钟
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