大肠埃希氏菌(O157：H7)荧光定量PCR检测试剂盒

大肠埃希氏菌(O157：H7)荧光定量PCR检测试剂盒使用手册
大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌（Escherichia coli），属于革兰氏阴性细菌。 大肠杆菌 O157:H7 是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的最常见类型，O 表示抗原类型, H7 表示血清型。其感染剂量极低， 人体只要摄入 10 个细菌就可以致病，目前还没有疫苗，因此大量开展预防 检测工作具有重要的意义。目前对 O157 的检测主要是传统分离培养、免疫学 和分子水平的 PCR 检测。本试剂盒就是利用实时荧光定量 PCR 技术开发的大 肠杆菌 O157:H7 检测试剂盒，它通过荧光染料实时显示样品模板 DNA 的量， 并通过坐标曲线表示出来，结果直观准确。它具有下列特点： 1. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。 2. 荧光定量 PCR 检测，反应特异性强。 3. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

大肠埃希氏菌(O157：H7)荧光定量PCR检测试剂盒使用方法 一、样品 DNA 的制备
用自选方法提取细菌样品 DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的
关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检
测灵敏度。
二、制备 O157:H7 标准曲线（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标
准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样
品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品
不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DNA 片段
作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（最好用带芯枪头，下同）
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。
4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 O157:H7 阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。
5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5拷贝/μL 的阳性对照。
6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6个稀释度的阳性对照。
7. NC 管中不加任何阳性对照。
8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。大肠埃希氏菌(O157：H7)荧光定量PCR检测试剂盒