三聚qing胺（Melamine）定量检测试剂盒（ELISA

三聚qing胺（Melamine）定量检测试剂盒（ELISA）


三聚qing胺（Mel）定量检测试剂盒（ELISA）

使用说明书

一、概要

三聚qing胺（Melamine），俗称密胺、蛋白精，是一种重要的氮杂环有机化工原料，白色结晶粉末。主要用于涂料、塑料、肥料和清洁产品等, 不可用於食品加工或食品添加物。近年有发现三聚qing胺添加到牛奶中，以提高牛奶蛋白浓度，可导致婴儿肾结石和肾功能衰竭，危害极大。

酶联免疫快速检测试剂盒具有成本低廉、操作简便、一次处理样本量大等优点，已成为常规的初步筛查方法。本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

二、用途

定量检测牛奶样本中三聚qing胺（Mel）的残留。

三、检测原理

本试剂盒采用竞争酶联免疫试验。检测的基础是抗原抗体反应，微孔板预包被羊抗鼠IgG捕获抗体，加入鼠抗三聚qing胺抗体后，会与捕获抗体连接。经过孵育及洗板后，加入标准品、样品及三聚qing胺酶标记物（Mel-HRP），游离的三聚qing胺（Mel）与三聚qing胺酶标记物（Mel-HRP）竞争三聚qing胺抗体结合位点。经过孵育及洗板后，加入底物并孵育。结合的酶连接物将底物转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450 nm 处测量，吸光度值与样品中的三聚qing胺浓度成反比，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数即可得出样品中三聚qing胺的含量。

四、检测限

检测限：5ng/ml（5ppb）

五、特异性

三聚qing酸……………………………………………2%

六、试剂盒组成

每一个盒中的试剂足够进行96 个试验（包括标准测定），试剂盒中的组份如下：

1、96孔酶标板1块（12孔×8条）：预包被羊抗鼠IgG

2、标准液×6瓶（1ml/瓶）：

0ng/mL、5ng/mL、15ng/mL、45ng/mL、135ng/mL、405ng/mL

3、酶标记物（6mL）：辣根过氧化物酶标记的三聚qing胺工作液

4、克伦特罗抗体（10mL）：鼠抗三聚qing胺单克隆抗体工作液

5、底物液A（6mL）：过氧hua脲

6、底物液B（6mL）：四甲基lian苯胺（TMB）

7、终止液（6mL）：2N

8、浓缩洗涤液（20×）（25mL）：含Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST）

9、其他：封板膜3张，自封袋1个，说明书1份

七、样本处理

处理任何样本，必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。取50μL清亮尿样直接测定，如尿样浑浊3000转离心10min，取上层清亮尿液测定，暂不使用的样本应于-20℃冷冻保存。

八、检测步骤

仔细的洗涤非常重要。避免在操作过程中微孔出现干燥。

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上。

2、准备：取出需要数量的微孔板，将用剩的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。将微孔板条插入微孔架，标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。

3、加抗体：每孔加入100μL抗体溶液，37℃恒温箱孵育30分钟。

4、洗板：倒出孔中的液体，将微孔架倒置在干净吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体。每孔加满稀释后的洗涤工作液，静置20秒钟，甩去液体，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。

5、加标准品/样品：加入50μL标准品或处理好的样品到各自的微孔中，标准品和样品做两个平行实验，然后加入50μL酶标记物到微孔，小心地充分混合，37℃恒温箱孵育30分钟。

6、重复3的操作。

7、显色：每孔先加入底物液A 50μL，再加入底物液B 50μL，37℃避光孵育15min（如果显色过浅，可适当延长孵育时间，反之亦然）。

8、测定：每孔加入终止液50μL，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。

九、结果判定

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	B	×100%
	B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ppb标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以三聚qing胺标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克仑特罗的实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

十、注意事项

1、严格按照说明书操作时间，每加一种试剂前需要将其摇匀，各操作步骤紧凑进行。

2、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

3、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

4、试剂变质的迹象

底物有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到25min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。

7、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

十一、贮存条件及有效期

贮存条件：2-8℃、干燥避光防潮。

有效期：在正确贮存条件下，有效期为12个月。

试剂盒组成

名称	96孔配置	48孔配置	备注
微孔酶标板	12孔×8条	12孔×4条	无
标准品	0.3mL	0.3mL	无
样本稀释液	6mL	3mL	无
检测抗体-HRP	10mL	5mL	无
20×洗涤缓冲液	25mL	15mL	按说明书进行稀释
底物A	6mL	3mL	无
底物B	6mL	3mL	无
终止液	6mL	3mL	无
封板膜	2张	2张	无
说明书	1份	1份	无
自封袋	1个	1个	无

注：标准品浓度依次为：8、4、2、1、0.5、0 ng/ml.
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法

1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步骤

1. 从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；
4. 随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断
绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

试剂盒性能

1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2. 灵敏度：最低检测浓度小于0.1 ng/ml。
3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性：板内变异系数小于10%、板间变异系数小于15%。
5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6. 有效期：6个月

免责声明

1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。

appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
8. Read the Optical Density (O.D.) at 450 nm using a microtiter plate reader within 15 minutes.
Calculation of results

1. This standard curve is used to determine the amount in an unknown sample. The standard curve is generated by plotting the average O.D. (450 nm) obtained for each of the six standard concentrations on the vertical (Y) axis versus the corresponding concentration on the horizontal (X) axis.
2. First, calculate the mean O.D. value for each standard and sample. All O.D. values, are subtracted by the mean value of the zero standard before result interpretation. Construct the standard curve using graph paper or statistical software.
3. To determine the amount in each sample, first locate the O.D. value on the Y-axis and extend a horizontal line to the standard curve. At the point of intersection, draw a vertical line to the X-axis and read the corresponding concentration.
4. Any variation in operator, pipetting and washing technique, incubation time or temperature, and kit age can cause variation in result. Each user should obtain their own standard curve.
5. The sensitivity by this assay is 0.1 ng/mL.
6. Standard curve

Storage： 2-8℃.
validity： six months.

FOR RESEARCH USE ONLY; NOT FOR THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC APPLICATIONS! PLEASE READ THROUGH ENTIRE PROCEDURE BEFORE BEGINNING!