PCR法DNA探针标记试剂盒

原理及特点
PCR法DNA探针标记试剂盒标记的原理是用带标记的 dNTP 进行 PCR，最后得到的 PCR 产物
将带有标记，可以直接用于杂交试验。其原理示意图如下：
PCR 法制备 DNA 探针示意图
PCR法DNA探针标记试剂盒是在上述原理的基础上开发，它具有下列特点：
1. 一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。
2. 足够 10 次 50 uL 体系的常规 PCR（用于制备标记反应的模板和设置对照反应）和 5 次 50 uL 体系的标记反应。
3. 一次标记可以得到ug级的双链DNA探针或约700ng 的单链DNA探针，足够多次杂交实验用。
4. 既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。
5. 90604A 需自备含标记核苷酸的 dNTP， 90604B 和 90604C 分别含生物素和标记的底物。自备的标记包括 fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。
6. 本产品得到的探针参入率一般为 4-5%（每 100 个核苷酸中有 4-5 个将带有非同位素标记），有效降低了空间阻碍，检测效果最佳。
7. 可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析
运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年
自备试剂 DNA 模板和模板专一性引物。
使用方法 一：准备工作
1. 按常规的方法设计 PCR 引物，使探针长度在 400-800bp 之间。过短则标记参入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2. 根据 PCR 引物优化 PCR 条件。
3. 由于标记的 dNTP 比较珍贵，所以本试剂盒不推荐以基因组 DNA 或其他复杂 DNA为模板直接进行 PCR 标记，而是建议采取下述的两步法标记来提高成功率，即先制备非标记 PCR 产物，再以之为模板制备标记的 PCR 产物。
相关试剂盒如下：
ROX内参染料，25uM
核苷酸类似物法易错PCR试剂盒（停）
即用型PCR试剂盒3.0（1 mL），含染料(2×Taq MasterMix)
即用型PCR试剂盒3.0，含染料
即用型长片段PCR试剂盒
即用型多重PCR试剂盒
即用型高保真PCR试剂盒
即用型热启动PCR试剂盒
即用型易错PCR试剂盒（有升级产品160903）
即用型荧光定量PCR试剂盒（1mL）
可调式易错PCR试剂盒
免DNA提取PCR试剂盒
探针标记专用PCR Mix（见关联产品）
10nt随机引物，0.5 ug/uL
6nt随机引物（抗水解），0.5 mM
6nt随机引物，0.5 ug/uL
cDNA第二链合成试剂盒（1103-1）
cDNA第一链合成试剂盒（逆转录试剂盒、RT试剂盒，50次）
miRNA cDNA第一链合成试剂盒
miRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒
Oligo dT12-18引物，0.5 ug/uL
天净沙抗污染RT Mix，2×
一管式反转录试剂盒（RT MIX）
一管式双链cDNA合成试剂盒
单酶一管式RT-PCR试剂盒（Tth）（见关联产品）
即用型荧光定量RT-PCR试剂盒（50次）
两管式RT-PCR试剂盒（AMV-Taq）（见关联产品）
两管式RT-PCR试剂盒（MMLV-Taq）
免RNA提取RT-PCR试剂盒
双酶一管式RT-PCR试剂盒(MMLV-Taq)
一步式RT-PCR Mix
通用型全基因组扩增试剂盒
LAMP可见光染料
LAMP扩增阳性对照
核酸稀释液，测OD专用
通用型LAMP试剂盒
通用型RT-LAMP恒温扩增试剂盒
SP6体外转录试剂盒
T3体外转录试剂盒
T7体外转录试剂盒
天净沙Ribo-SPIA cDNA扩增试剂盒
天净沙SPIA扩增试剂盒（用于扩增DNA模板）（见关联产品）
天净沙通用型MLPA试剂盒（）
单细胞裂解液（DNA）
单细胞裂解液（RNA）
单细胞全转录组扩增试剂盒
单细胞悬浮液
胚胎裂解液
常用PCR引物
DNA磷酸化试剂盒
DNA去磷酸化试剂盒
DNA粘转平试剂盒
加A试剂盒

二：非标记 PCR 产物的制备
4. 设置 50 uL PCR 的反应体系：
5. 按已经优化的 PCR 参数进行 PCR。
6. 电泳检测和胶回收所需的 PCR 产物，并定量。用 10 pmol 引物一般能得到 1ug 左右的 PCR 产物（具体取决于 PCR 产物的长度）。注意：最好采取胶回收而不是 PCR回收以避免残留引物干扰后续的标记 PCR。
三：标记 PCR 反应（最好做一个不加标记的对照用于定量）说明：在设置下面反应时，如果加一种引物，就得到单链标记的 PCR 产物；如果加两种引物，则得到双链记的 PCR 产物。由于双链 PCR 探针在杂交前虽然要变性成单链后使用，但杂交时变性的双链彼此还会复性，这种复性会与探针-靶 DNA 杂交反应相竞争，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记的 DNA 探针。 

注意：PCR法DNA探针标记试剂盒提供的 dNTP 混合物中，标记底物与非标记底物的比例已经进过优化，如果自备标记 dUTP，其与 dTTP 的最佳比例需要优化，标记不同，比例不同。对DIG-11-dUTP，最佳比例 1：3；对 BrdUTP，最佳比例为 1：1。
7. 按第 5 步的 PCR 参数进行标记 PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到 35-55个循环。由于模板为纯化后的 PCR 产物，探针对扩增长度完整性要求不高（长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好），所以可以增加循环数；二是延伸时间增加 15 秒，因为标记 dUTP 参入到 DNA 的速度比常规的 dTTP 慢；三是降低复性温度 5-7℃，因为标记核苷酸参入到 DNA 后，新模板的 Tm 值将降低。
8. 标记探针的定量：取标记反应和对照反应的产物 1-5 uL，在琼脂糖凝胶上跟浓度已知的 DNA marker 一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记反应的 PCR 产物中额外带有非同位素的配体（生物素，等）、因此其泳动速度将慢于非标记 PCR 产物（但同位素标记不能用此法）。是下图是一个典型的双链 PCR 产物电泳结果图：

注意：如果扩增的是单链 DNA 探针，其结合 EB 的能力远低于双链 DNA（EB 是嵌合到双链碱基对之间的，而单链 DNA 没有碱基对，只有一些局部区域折叠形成的有限双链区，因此能结合的 EB 很少），因此 EB 染色的强弱不能准确反应 DNA 的浓度，可以采用银染定量（跟 marker 比较）。一般 100ng 模板按上述条件经过单链 PCR 扩增可得到700ng 左右探针。
9. 剩余的 PCR 标记产物可以不经过纯化，直接加入（对单链 PCR 探针）杂或加热变性并急冷后加入（对双链 PCR 探针）到杂交液中使用。如果暂时不用请放-20℃长期保存。如果需要纯化，请使用乙酸铵/乙醇沉淀法。