AMV逆转录酶厂家

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

百奥莱博专业生产供应AMV逆转录酶厂家，我公司销*(代"售")全品类的分子生物学试剂，价格优惠，欢迎广大科研工作者垂询订购。

名称：AMV逆转录酶厂家
编号：BTN90502
规格：200U
英文名：AMV Reverse Transcriptase
品牌：百奥莱博
AMV逆转录酶分离自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)，其方法由Houts等人的方法改进而来。分离得到的酶是分子量为157KD的αβ全酶。本酶经高度纯化，完全无核酸酶污染。本酶可用于cDNA合成，也可用于RNA和DNA的双脱氧测序。AMV逆转录酶以总RNA或polyA+ RNA为模板，具有以RNA为模板的DNA聚合酶活性，DNA为模板的DNA聚合酶活性和RNase H酶活性，最适反应温度在42-55℃，最高可达60℃，如果使用焦磷酸*，最适温度为37-41℃。按照标准使用方法可以得到长至10-12 kb cDNA。本AMV逆转录酶比普通AMV逆转录酶和MMLV逆转录酶能耐受更高的温度和合成更长的cDNA。

产品特点：
1．高灵敏度,可以1ng的总RNA进行cDNA合成。
2．反应温度可升高到60℃，可有效打开RNA二级结构，适用于二级结构复杂的RNA模板。
3．可合成长至10-12kb的cDNA。
4．可用于first strand cDNA合成、RT-PCR、RNA测序和双脱氧法DNA测序、引物延伸和DNA片段的3´-末端标记。
5．本酶具有内源性的RNase H活性，所以最好不要用于cDNA文库的构建。

产品组成：

 

成分	规格
AMV 逆转录酶(10U/μL)	20μl
5×AMV Buffer	200μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

活性定义：以poly(rA)为模板，以oligo(dT)12-18 为引物，在37℃温度下，在10分钟将1nmol的dTMP掺入入到多核苷酸中所需酶量为一个单位。

使用方法：(合成1st-strand cDNA)
1．按下表配制RT反应体系:

加入物	加入量
总RNA 或poly(A)mRNA 或专一的RNA	500-2000ng 50-500ng 0.05pg-500ng
注：RNA样品不能有基因组DNA污染。
Oligo(dT)18(0.5ug/μL) 或随机引物(0.2ug/μL) 或RNA模板专一性引物	1μL 1μL 15-20pmol
注：随机引物于RNA模板的比例跟最后得到的cDNA的平均长度成反比
RNase-free水	补水到11μL

2．70℃保温5分钟后立即冰浴。
3．严格按下表顺序加入各成分：

5×AMV Buffer(本产品提供)	5μL
RNase Inhibitor(40U/μL,自备)	1μL
焦磷酸* 40mM(预热到42℃)	2.5μL
dNTP(10mM each,自备)	2.5μL
AMV逆转录酶	1-3μL(=10-30U)

4．补水使反应终体积为25μL。
5．42℃保温60分钟(对Oligo dT引物或模板专一引物)或37℃保温60分钟(对随机引物)。如果不使用焦磷酸*，反应温度可以提高到42-55℃，最高可达60℃。
6．70℃保温10分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。50μL Taq DNA聚合酶催化的PCR体系中最多可以使用25μL的RT产物，一般使用10μL AMV催化的RT产物即可。

我公司的AMV逆转录酶厂家，性价比高，货期短，送货上门，欢迎您来电咨询购买，另外，我公司还生产供应销*(代"售")下列产品：

·Tris盐*(代"酸")溶液(1M,pH8.0)(不含RNase)
编号：BTN170103
英文名称：RNase-Free Tris-HCl Solution
规格：250mL

·电泳级SYBR Green I
编号：BTN3280
英文名称：SYBR GreenⅠ, electrophoretic grade
规格：50μL
SYBR Green I，EG是电泳级低毒高灵敏的花青类DNA荧光染料，适用于各种核酸电泳分析。

产品特点：
1.低毒安全，其致突变性低于EB 数倍甚至数十倍。
2. 髙灵敏，SYBR Green I与dsDNA 结合，荧光信号会增强800-1000倍，至少可检出 20 pg DNA，灵敏度高于EB染色法10－25倍。
3.适用范围广，可适用于多种电泳分析，包括琼脂糖凝胶，聚丙*(代"烯")酰胺凝胶电泳和毛细管电泳等。与我司的SuperBuffer-2 兼容。
4. 不影响其它修饰酶(Taq酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等)作用。
5. 操作简单，无须脱色或冲洗。

储存条件：常低温运输，-20℃闭光保存，有效期一年。

使用方法之一：电泳前染色
 本方法是在上样时对DNA进行染色，只适于琼脂糖凝胶电泳。
1. 用高纯度的无水DMSO 将10000×的SYBR Green I 稀释100倍成100×电泳前染色液。染色液可以在-20℃和闭光条件下可以保存一个月以上。
2. 按常规方法制备胶，胶的厚度最好不要超过5mm，胶中不能含任何染料。
3. 将100 X电泳前染色液与DNA样品(包括DNA Marker)按1：10的比例混合，室温放置10-15分钟，加上样液后上样。
4.上样后电泳。
5.在300nm的UV下观察。UV的功率最好为90W(15W X 6)，手持UV一般功率不够，难以得到满意的灵敏度。除300nm外，SYBR Green I还可以在500nm和380nm的激发光下观察(如使用Dark Reader 蓝色可见光透色仪)。也可以用激光扫描仪记录电泳结果。
6. 用配置了520-550nm 滤光片(一般呈黄色或深黄色)的相机拍照。
 注意：不要使用与EB 兼容的红色滤光片(能阻挡520-550nm的光)。如果能再加上能滤去UV的滤光片，效果会更好。
7.后续Southern或Northern转膜或胶回收按常规操作进行。

使用方法之二：电泳中染色
 本方法是将SYBR Green I 加入到琼脂糖凝胶中，优点是不需要额外的染色处理，只适于琼脂糖凝胶电泳。
1. 将10000×SYBR Green I 直接加入到融化的、但温度已经降低到50℃左右的琼脂糖凝胶中，使其终浓度在0.5-1X左右，混合均匀后倒胶，厚度最好不要超过5 mm。
2. 按常规方法上样和电泳。
3.电泳后观察和照相处理同方法一。
 注意：由于在琼脂糖凝胶中的SYBR Green I在加热融化时会大量分解，所以琼脂糖凝胶最好需要多少配多少。

使用方法之三：电泳后染色
 本方法是在电泳后对DNA进行染色，适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE，检测灵敏度可达20 pg DNA，但该方法需要单独的染色处理。
1. 按照常规方法进行电泳。
2. 用pH7.0-8.3的缓冲液(如：TAE，TBE或TE)将10000×SYBR Green I 稀释10000倍成1×电泳后染色液。
3. 将电泳后染色液倒入合适的聚丙*(代"烯")容器中，放入琼脂糖凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-30分钟。对聚丙*(代"烯")酰胺凝胶，可取下一块玻璃板，然后将配好的电泳后染色液轻轻地倒在PAGE胶板上，让染色液均匀地覆盖整个PAGE胶板，静置染色30分钟。避免让染色液与玻璃表面接触。
4. 观察和照相处理同方法一。
 注意：电泳后染色液可以冷冻避光储存一个星期。反复使用次数取决于胶的大小(胶越大，非特异吸附产生的损耗就越大)，一般可重复使用4次。

注意事项：
1. 融化：本产品溶于DMSO中，融化时一定要让其彻底融化，否则SYBRGreen I在液相和固相中浓度不均，影响实验的可重复性。
2. 容器：SYBR Green I 对聚丙*(代"烯")材料的亲和力非特意吸附最小，故建议在稀释、贮存、染色等使用过程中使用专用的聚丙*(代"烯")类容器，容器表面会被染成橙色。不要使用玻璃和非聚丙*(代"烯")容器。
3. 反复使用：由于凝胶和容器的非特意吸附，使用过的SYBR Green I 再染色时效率会逐渐降低。
4. 稳定性：稀释后的SYBR Green I工作液体最适保存条件是闭光、密封、低温(4℃)、pH在7.5-8.3。避免将本产品直接加入热的琼脂糖凝胶中，禁止用微波加热处理SYBR Green I。
5. 稀释液：可以用电泳缓冲液稀释SYBR Green I，包括常用的TAE、TBE、TE、SuperBuffer-2等。最好不要使用水和pH7.8(25℃)的Tris缓冲液。后者的pH在4℃时会升高到8.4。
6.其他影响因素：染色液中最好不要有SDS，也不要用去污剂洗涤染色用的聚丙*(代"烯")容器时，0.1-.3% SDS 能抑制SYBR Green I与DNA 结合。用deaza-G 替代G的DNA 不能有效染色。

疑难解答：
Q：DNA 条带为何出现弯曲或模糊？
A：DNA 过量，将DNA 用量降低到1-5 ng/条带。电泳时间不要超过2小时，否则SYBR Green I 会从DNA上分离出来，会产生弥散状条带。电压不能太高，否则产热会影响SYBR Green I与DNA的结合。
Q：醇/盐沉淀法能否把结合在DNA上的SYBR Green I 去掉？
A：可以。其中乙醇效果最好，异丙醇次之。但正丁醇、*仿和*酚抽提不能去除与DNA 结合的SYBR Green I。
Q：用SYBR Green I 染过的胶能否用于Southern或Northern Blot？
A：可以，但最好在预杂交和杂交溶液中加入0.1%-0.3%的SDS。SDS 能是SYBR Green I与DNA 分开。
Q：能否用SYBR Green I染色膜上的DNA。
A：可以用来染色带正电的尼龙膜上的DNA，不能用于中性尼龙膜和硝酸纤维素膜。


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·柱式血液RNA大量提取试剂盒
编号：BTN80902
英文名称：Blood RNA Column large-scale extraction kit
规格：5次
本试剂盒是在柱式血液RNA提取试剂盒(BTN71202)基础上开发的大提升级产品，专门从动物全血样品中快速提取总RNA。跟柱式血液RNA提取试剂盒相比，本产品具有下列特点：
1.大量提取，每次最多可处理 30mL血液。
2. 操作简单快捷，直接使用新鲜的或冷冻的抗凝全血样品，不需要裂解红细胞等任何预处理步骤，整个提取过程只需要十分钟左右，可以全在室温下进行。
3. 纯度高，OD260/OD280 均在2.0左右，得到的RNA可以直接用于RT-PCR和Northern杂交等研究。
4.产率一般为2-5μg/mL人血。
5.与常用的抗凝剂(包括肝素，EDTA，柠檬酸*，草酸*)兼容。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	100ml
溶液B	30ml
溶液C	100ml
大提离心吸附柱	5套
通用洗柱液	100ml
RNA洗脱液	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

1. 将10-30mL 新鲜或解冻后的抗凝全血加入到50mL塑料离心管中。
2. 12000～15000g室温离心5分钟，弃上清(血浆)。
3. 将20mL溶液A加入到血液细胞沉淀中，用移液枪吹打沉淀使细胞裂解。
4. 将6mL的溶液B和4mL *仿加入到离心管中，剧烈震荡30秒。
5. 12000～15000g室温离心3～5分钟，将上清液(为无色或浅红色)转移到另一干净离心管中。注意：转移的液体不要超过25mL，否则下一步不能加入等体积的溶液C。为防止污染，最好留少量上清液。下层有机相一般呈深红色，中间层为白色，含有DNA，蛋白质和其他细胞破碎物，避免触及或吸取。
6. 加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。
7. 分两次将溶液转移到离心吸附柱中，每次转移后12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。
8. 加 25mL 通用洗柱液，室温离心半分钟，弃穿透液。
9. 重复步骤 8一次。
10.室温 12000～15000g离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响RNA的后续反应。
11. 将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入1mL RNA 洗脱液，室温放置1-2分钟。
12. 12000～15000g室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
13. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子(BioTechniques，28：414，2000)。
14. RNA产量产率测定：将5-10μL RNA溶于TE缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度(1 OD260的RNA=40μg/mL)，进而计算出RNA的产量(浓度X 体积)和产率(RNA产量/组织用量)。人血RNA产率一般为2-5μg/mL。
15. RNA 纯度测定：无污染的总RNA的OD260/OD280一般在2.0左右(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质污染，但一般不影响RT-PCR等反应。

疑难解答：
Q: 如何去除RNA样品中的DNA污染？
A:可以使用百奥莱博的非酶DNA 清除剂DNA ERASOL-2。
Q: 为何有的样品在第6 步离心后有很厚的中间层，上清很少。
A: 这是因为蛋白质变性不充分，可以适当减少血液的用量。白细胞多的血液容易产生这种情况。


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·dGTP溶液(2.5mM)
编号：BTN130914
英文名称：dGTP Solution(2.5mM)
规格：2mL
dGTP分子式为C10H13N5O13P3Na3,分子量是507.2，消光系数为13.7×103 M-1×cm-1(pH7.0)。λmax为253nm。

储存条件：低温运输和-20℃保存、有效期一年。

·端粒酶重复片段扩增试剂盒(TRAP试剂盒)
编号：BTN111009
英文名称：Telomeric Repeat Amplification Protocol Kit
规格：50次
本品是我司在经典TRAP技术基础上改良而得，专门用于快速测定人类细胞端粒酶的相对活性(需要跟对照样品比较)。端粒酶存在于85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是TRAP，它利用端粒酶能在外加的TS模板DNA的末端添加不同数量的TTAGGG序列这一特点，通过PCR检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。原理如下：


产品特点：
1．一站式，提供从细胞裂解到PCR的所有试剂，但不含PAGE和银染试剂。
2．一管式操作，端粒酶延伸和PCR在同一体系中完成，方便快捷。
3．提供改良的、长为150bp的内参和含8个端粒序列的合成端粒，可有效排除PCR假阴性。内参长度远大于TRAP产物，不会干扰结果分析。
4．改良的TS模板和PCR引物，极大降低了引物二聚体的形成。
5．既可用于培养细胞，也可用于实体组织。
6．灵敏度高，最低可以检测到10个肿瘤细胞中的端粒酶活性。

试剂盒组成：

成分	规格
TRAP细胞裂解液	10mL
PCR Mix 3.0	1.5mL
合成端粒(PC)	50μL
TS-引物混合物(含内参)	300μL
超纯水	1mL
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、端粒酶的提取
注意：端粒酶是蛋白质和RNA组成的复合体，RNA极容易被降解，因此，提取端粒酶应该跟提取RNA一样，尽量在低温条件下快速操作，并且必须使用RNase-free的耗材，桌面最好用固相RNase清除剂清洁(BTN3090)清洁。
1．对冷冻的实体组织：将50-100mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末，再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入200μl预冷的TRAP细胞裂解液，温和手动匀浆数次后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次，然后直接进入第3步操作。为保证裂解效果，可在显微镜下观察。如果组织样品不足50-100mg，可以按比例降低TRAP细胞裂解液的用量。
2．对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷PBS洗涤105-106个经过胰酶处理的细胞或50-100mg新鲜组织，3000g 4℃离心5分钟，弃上清；加入200μL预冷的TRAP细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞：涡旋振荡10秒后置冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次。对组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔匀浆后冰浴30分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共5-6次。如果细胞不足1×106或50-100mg，可按比例降低TRAP裂解液的用量。
3．12000-14000g 4℃离心20分钟。
4．收集160μL上清，先取部分用于测定蛋白质浓度，可通过测定215nm和225nm的光吸收得到，计算公式是蛋白质浓度(μg/μL)=0.144×(A215-A225)×稀释倍数，也可使用BCA法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在10-750 ng/μL。知道各样品的蛋白浓度后，可用TRAP细胞裂解液将各样品的蛋白浓度调成一样便于比较，然后按10μL/管分装得到至少15管裂解物，放-80℃冷冻保存(可存放一年)。每个样品可取一管进行热灭活(95℃处理10分钟)后再放-80℃冷冻保存，此管将作为该样品的阴性对照。

二、TRAP反应
5．确定每个TRAP反应的细胞裂解物用量：为便于分析比较，每个TRAP反应所用的蛋白量(或细胞数)必须一样。由于细胞裂解物中一般都有高浓度的不明Taq DNA聚合酶抑制物(TRAP失败最常见的原因)，因此最佳结果往往是用稀释10-1000倍后的细胞裂解物得到。建议用一个样品稀释不同浓度做TRAP预实验。
6．在PCR管中按下表设置TRAP反应(50μL反应体系，以A和B两个样品为例)：

成份	A样品管	A阴性 对照管	B样品管	B阴性 对照管	实验 阴性对照	实验 阳性对照
A样品	2μl	-	-	-	-	-
A阴性对照	-	2μl	-	-	-	-
B样品	-	-	2μl	-	-	-
B阴性对照	-	-	-	2μl	-	-
TRAP细胞裂解液	-	-	-	-	2μl	-
合成端粒	-	-	-	-	-	2μl
TS引物混合物	6μl	6μl	6μl	6μl	6μl	6μl
PCR Mix	25μl	25μl	25μl	25μl	25μl	25μl
超纯水	17μl	17μl	17μl	17μl	17μl	17μl

 注：为避免污染，最好等其他样品加完并盖上盖后再加合成端粒。
7．吹打混匀后进行PCR扩增，扩增条件(仅供参考，用户可优化)如下：

步骤	温度	时间
端粒酶延伸	30℃	30min
端粒酶灭活	95℃	5min
PCR(循环35次)	94℃	30s
	55℃	60s
	72℃	30s

三、PAGE-银染检测及结果解读(本试剂盒不含PAGE-银染检测试剂盒)
8．取5μL PCR反应液进行10%非变性PAGE电泳-银染显色实验(需另购本公司PAGE电泳套装和银染试剂盒)。如果背景高(主要是由反应体系中的蛋白成分引起)，可以先进行PCR产物纯化再进行PAGE电泳和银染。
9．跟预期结果(见下表)比较。如果结果跟下表不一致，则需要按具体情况分析原因。

现象	样品管结果	样品阴性 对照结果	实验阴性 对照结果	实验阳性 对照结果
典型TRAP条带 (条带数不限)	有则有端粒酶活性 无则无端粒酶活性	不出现	不出现	不出现
阳性对照的TRAP 条带(仅8条带)	不出现	不出现	不出现	出现
150bp内参	可出现可不出现	出现	出现	出现

 注：本试剂盒所用引物产生的典型TRAP条带最小条带为59bp。

疑难解答：
1．如果样品管有内参带，但没有TRAP条带，可能是端粒酶活性低或者失活。制备细胞裂解物时可在TRAP细胞裂解液中加入1/100体积的RNase抑制剂以抑制RNase活性，并在端粒延伸反应后增加DNA纯化一步，纯化后的DNA再用于PCR。此两步法TRAP需要用户自备DNA纯化试剂和dNTP。
2．如果样品对照管(端粒酶已经灭活)出现TRAP条带，可能是TRAP产物污染，需要使用洁净的PCR管和PCR试管架。样品制备、PCR设置和电泳需在不同房间进行。也可能是端粒酶没有彻底灭活，建议用RNase酶解法或酶解+热灭活法。
3．实验阴性对照管的实验结果中出现TRAP条带，可能是引物二聚体，可采取两步法TRAP，并且将DNA模板加入到70℃预热的PCR Mix3.0中再进行PCR。
4．实验结果不好时，可以直接采取2步法，先做端粒酶延伸和灭活，然后再纯化DNA，用纯化的DNA做PCR。此法需要用户自备dNTP。

北京百莱博科技有限公司专业生产工具酶产品，欢迎来电咨询选购AMV逆转录酶厂家。