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- NobleRyder
- P4810
- 北京
- 2025年12月14日
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99
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北京诺博莱德科技有限公司
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多种成分均可以从细胞中提取总蛋白，如 Triton、SDS、NP-40 等。NP-40 裂解液(NP-40 Lysis Buffer)是采用一种温和的裂解方法获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于 PAGE 电泳、 Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation ， IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
NobleRyder NP-40 Lysis Buffer 主要由 Tris-HCl、NaCl、NP-40 以及 sodium pyropho-sphate，β-glycerophosphate，sodium fluoride, EDTA 等多种蛋白酶抑制剂组成。用NP-40 Lysis Buffer 得到的蛋白，可以用 BCA 蛋白定量试剂盒和 Bradford 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
产品组成：
| 编号 名称 |
P4810 | Storage |
| NP-40 Lysis Buffer | 100ml | -20℃ |
| PMSF(100mM) | 1.5ml | -20℃ |
| 使用说明书 | 1份 | |
(一)贴壁培养细胞
1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。
2、去除贴壁细胞的培养液，用 PBS、NS 或无血清培养液清洗 1 次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
3、按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 NP-40 Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解 15～30min，通常裂解液作用于细胞 1～3s内，细胞就会被裂解。
4、10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5、进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
2、用手指轻弹细胞，使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150～200μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 NP-40 Lysis Buffer 。通常 6 孔板每孔细胞加入 150μl 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
3、10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
4、进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
1、取 NP-40 Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mm。把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
2、取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控
制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。
3、按照每 20mg 组织加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 30～60min。
4、 步骤 3、4 亦可以采用如下过程：按照每 20mg 组织加入 150～250μl 裂解液的比例，加入含有 PMSF 的 NP-40 Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。
5、10000～12000g，4℃离心 5～15min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
6、进行后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项：
1、在贴壁培养细胞的操作步骤中，去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
3、在培养细胞的裂解中，如果细胞量较多，必需分装成 50～100 万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
4、 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5、溶解 NobleRyder NP-40 Lysis Buffer 时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。
6、细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或 4℃进行。
7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
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文献和实验，比如 RIPA，虽然裂解剧烈，但是无法维持蛋白天然构象，会破坏互作蛋白对。 如果自配，建议采用温和系统，比如 NP40/Triton 0.1%-1%；SDS ≤0.1%，盐离子≤150 mM 记得要加蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂 结合液---利于蛋白之间的相互结合，要考虑孵育（结合）顺序 如果抗体和 beads 先孵育，建议 选择 pH 8.2（更常用）或者 pH 5.0 如果选用纯抗原作为诱饵蛋白 X 去拉裂解液中的靶蛋白 Y，抗体和抗原的结合 buffer 选择中性PBS/TBS 如果诱饵蛋白 X
A蛋白抗体，B蛋白抗体沉淀蛋白。1）.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。 2）.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1-3个小时。为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升。3）.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose。4）.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS
(pH8.5~9.0)，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml溶菌酶。 10、我们用NP40（NP40：NONIDET p-40 乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加DTT和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放30－60min，然后13000rpm离心15min，取上清定量。 11、裂解液配方是：50mmol/L Tirs-HCI (PH 8.0)，150mmol/L NaCI，0. 02% 叠氮钠，100μg/ml PMSF，1μg
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