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- NobleRyder
- P4811
- 北京
- 2025年12月14日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
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99
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12个月
- 供应商：
北京诺博莱德科技有限公司
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已收到实际货物为准
产品简介：
多种成分均可从细胞中提取总蛋白，如Triton、SDS、NP-40等。RIPA裂解液(弱) (Weak RIPA Lysis Buffer )是采用一种温和的裂解方法获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可用于PAGE电泳、Western、免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。
NobleRyder Weak RIPA Lysis Buffer主要由Tris 、NP-40、sodium deoxycholate等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。
产品组成：
| 编号 名称 |
P4811 | Storage |
| Weak RIPA Lysis Buffer | 100ml | -20℃ |
| PMSF(100mM) | 1.5ml | -20℃ |
| 使用说明书 | 1份 | |
操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁培养细胞
1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
2.去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。
3.按照6孔板每孔加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例， 加入Weak RIPA Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于细胞1～3s内，细胞就会被裂解。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。
4.10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5.后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(二)悬浮培养细胞
1.取Weak RIPA Lysis Buffer 置室温溶解混匀后，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
2.低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。
3.用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μl含有PMSF的裂解液的比例，加入Weak RIPA Lysis Buffer 。通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μl。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
4.10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
5.进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
(三)组织样本
1.取Weak RIPA Lysis Buffer置于室温溶解混匀后，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。
2.把组织剪切成细小的碎片，越小越好。
3.取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
4.按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。
步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μl裂解液的比例加入含有PMSF的Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。
5.10000～12000g，4℃离心5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。
6.进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
注意事项：
1.去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
2.如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
3.如果细胞量较多，必需分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
4.如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5.溶解NobleRyder RIPA Lysis Buffer时，应尽量缩短溶解时间，避免有效成分失效。
6.裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-KB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。
7.细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。
RIPA裂解液(弱)
有效期： 12个月有效。
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文献和实验，比如 RIPA，虽然裂解剧烈，但是无法维持蛋白天然构象，会破坏互作蛋白对。 如果自配，建议采用温和系统，比如 NP40/Triton 0.1%-1%；SDS ≤0.1%，盐离子≤150 mM 记得要加蛋白酶和/或磷酸酶抑制剂 结合液---利于蛋白之间的相互结合，要考虑孵育（结合）顺序 如果抗体和 beads 先孵育，建议 选择 pH 8.2（更常用）或者 pH 5.0 如果选用纯抗原作为诱饵蛋白 X 去拉裂解液中的靶蛋白 Y，抗体和抗原的结合 buffer 选择中性PBS/TBS 如果诱饵蛋白 X
的底物进行筛选。我们通过离体印迹磷酸化作用来确认可能的底物。总的来说，我们的方法能筛选植物蛋白激酶用于进一步的分析，随后的体内实验对评估它们的生理作用是必不可少的 [ 13，24，25 ]。2. 材料 2.1 非变性条件下重组激酶的纯化 ( 1 ) 培养细胞的培养基：含 100 μg/ml 氨苄青霉素，15 μg/ml 卡那霉素，2% 葡萄糖的 2YB 或 LB 培养基。 ( 2 ) 异丙基 β-D-硫代半乳糖苷（IPTG ) 。 ( 3 ) 非变性裂解液：300 mmol
膜干燥 保证充分的反应液，避免出现干膜现象 曝光过度 缩短曝光时间 抗体与阻断蛋白有交叉反应 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应 没有阳性条带，或者阳性条带比较弱
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