- ¥2000
- 大有泰莱
- 北京
- dy18010
- 2025年07月16日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
-20度保存
- 规格：
48T
（Taqman探针一步法实时荧光RT-PCR）
编号：KA004.01YB
规格：48头份
介绍：猪瘟（Classical Swine Fever ,CSF）猪瘟又称古典猪瘟，是由猪瘟病毒（CSFV）引起猪的一种高度接触性，症状差异极大的传染病。典型急性猪瘟是以高热、沉郁、出血、高发病率和高死亡率为主要特点。世界卫生组织（OIE）将其列为必须通报疾病。我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种明录》将其列为一类动物疫病。
用途：该试剂盒用于对CSFV进行检测，有助于对CSFV的实验室诊断、监测和流行病调查。
原理：本试剂盒采用一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应(One-Step Real Time RT-PCR) ，结合Taqman技术，对特异核酸进行定性或定量检测。
试剂盒的组成
| 试剂名称 | 数量 |
| CSF反应液 | 550μL×1管 |
| CSF酶 | 40μL×1管 |
| CSF引物探针 | 100μL×1管 |
| 无核酸水 | 1000μL×1管 |
| CSF阴性对照 | 1000μL×1管 |
| CSF阳性对照 | 150μL×1管 |
样品收集，操作和储存
1. 最好选择发病早期，无菌采样并立即送往实验室进行病毒检测。
2. 样品短期可在4℃冷藏保存，较长时间保存应在--20℃或者-70℃，并且避免反复冻融。
检测步骤
1.核酸提取
样品进行适当处理后，可采用本公司的核酸提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照提取试剂盒说明书进行操作。也可选择其他合适的商品化产品。
2.扩增试剂的准备
将样品数+1份阴性对照+1份阳性对照设为N，计算试剂所需量，反应体系配制见下表
| 试剂名称 | N份用量（20μL 体系） |
| CSF反应液 | 10μL×（N+1） |
| CSF酶 | 0.5μL×（N+1） |
| CSF引物探针 | 1.8μL×（N+1） |
| 无核酸水 | 5.7μL×（N+1） |
3.加样
将制备好的样本，阴性对照，阳性对照各取2μL分别加入对应反应管中，加完后盖紧PCR反应管盖，置于PCR仪上。
4.荧光PCR扩增与信号收集
| 循环数 | 温度（℃） | 时间 | 数据收集位点 |
| 1 | 45 | 15min | - |
| 1 | 95 | 2min | - |
| 40 | 95 | 15s | - |
| 60 | 1min | 数据收集 |
注：报告基团选FAM,淬灭基团选NONE。
结果成立原则
阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线。
阴性对照：无CT值或者CT值>37，线性为直线或者轻微斜线，无明显扩增曲线。
以上要求需同时满足，否则本次实验无效，需要重新进行。
结果判定
| CT值 | 样本检测结果 |
| <30并有明显的扩增曲线 | 阳性，样本中检测出CSFV。 |
| 30-37 | 可疑，需重复检测。若第二次检测CT值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。 |
| >37并无扩增曲线 | 阴性，样本中未检测出CSFV。 |
1.反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。
2.PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严禁器材和试剂倒流。
3.使用不含荧光物质的一次性手套，一次性离心管。
4.反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒应在5次内用完.
5．-20℃保存的各试剂管使用前应在室温下完全融化，液体融化后需彻底混匀，2000 rpm离心15 s ，使用后立即放回-20 ℃。
6．在RNA提取过程中，避免RNA酶污染，尽量缩短操作时间。
7．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。
8.PCR反应管避免气泡存在，管盖需盖紧。
9.不同批次的试剂盒勿混用。
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文献和实验请教real time PCR的RT部分能否使用传统半定量RT-PCR试剂盒的反转录部分？
各位老师： 您们好！偶欲做几个基因的RT-PCR实验。偶先用传统的半定量两步法RT-PCR试剂盒(TaKaRa DRR019A)扩增了几个基因，并用该试剂盒反转录了不少cDNA。但还有2个基因偶打算用real time PCR法来扩增。拟采用TaKaRa DRR041S试剂盒。但是TaKaRa DRR041S试剂盒说明书上写的反转录步骤是使用另外一个单独的RT Reagents (TaKaRa DRR033A)，得到cDNA再用TaKaRa DRR041S试剂盒扩增。但是仅一个RT
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