快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)供应

特别声明：本产品及我公司所售其他产品均为科研类试剂产品，严禁用于药物、医疗及其他非科研用途。

北京百奥莱博专注于生命科学和生物技术领域，致力于为客户提供包括快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)供应在内的一系列分子生物学试剂产品，并提供一系列相关的技术服务。

名称：快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)供应
品牌：百奥莱博
英文名：BaFaSYBR Mixture(Low ROX)
产地：国产|进口
规格：5ml
  本品是专用于染料法(SYBR GreenⅠ)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×,包含Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料和Mg2+，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后的cDNA靶序列检测。本品所含荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA相结合，使该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。本品含有的Fast Taq DNA Polymerase能有效减少在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活仅需在95℃孵育20s。整个PCR反应过程比普通反应可节省约40分钟，大大缩短了PCR的反应时间。独特的PCR缓冲体系与热启动酶的组合，有效抑制了非特异产物的产生，并显著提高PCR的扩增效率。该产品应用范围广，适用于普通和快速定量PCR程序，可适用于无需ROX校正的所有荧光定量PCR仪。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0141)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0142)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0143)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

产品组成：

 

组份	WE0141-5ml	WE0142-5ml	WE0143-5ml
2×BaFaSYBR Mixture	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
3、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。
4、本品不能用于探针法荧光定量PCR。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系：
 

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×BaFaSYBR Mixture	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。
2)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
3)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX.

2、PCR反应条件：
 

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	20 s
变性	95℃	3 s	35-40个循环
退火/延伸	60℃	30 s
融解曲线分析	95℃	15 s
	60℃	1 min
	95℃	15 s
	60℃	15 s

注意：
1)本产品所采用的酶须在预变性95℃、20s条件下实现酶的活化。在此条件下，大多数模板可良好的进行解链。对GC含量高、二级结构复杂的模板，可将预变性时间延长至1分钟，以使起始模板充分解链。若高温处理时间过长，会对酶的活性造成影响。可根据模板情况确定最佳的预变性时间。
2)建议采用两步法PCR反应程序，退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。
3)融解曲线分析请以所使用的荧光定量PCR仪推荐的程序进行设定，本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

关于快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)供应的更详细说明，请致电我公司咨询，我们将以最饱满的热情为您提供解答，此外，我公司专业供应下列产品：
ARB12045 大鼠乙酰辅酶A乙酰基转移酶(ACAT)尿液中含量检测 
ARB12024 大鼠β干扰素(IFN-β/IFNB)含量测试 Rat interferon β,ifn-β/ifnb ELISA KIT
ARB10635 人血管内皮生长因子(VEGF)酶标法分析 Human vascular endothelial growth factor，vegf ELISA KIT
*亚磺酸* Ribostamycin Sulfate salt 873-55-2
F030503 FITC标记小鼠抗乙肝表面抗原抗体 Monoclonal Mouse Anti-HBsAg*FITC
002002 无菌脱纤维兔血 100ml|500ml
BL0288 IMDM
ARB10359 人心房利*肽(h-ANP)酶联免疫定量检测 Human atrial natriuretic Peptide,h-anp ELISA KIT
ARB11020 人尿蛋白(UP)Elisa定量检测 Human proteinuria,up ELISA KIT
吩嗪乙基硫*(代"酸")盐 3,5-Dihydroxytoluene 10510-77-7
HC0057 盒装无菌滤芯吸头
2-脱氧-2,2-二*-D-赤型-1-呋*(代"喃")酮糖-3,5-二*甲酰酯 Acetylene tetrabromide 122111-01-7
ARB13306 小鼠癌胚抗原(CEA/CD66)Elisa方法检测 Mouse carcinoembryonic antign,cea ELISA KIT
快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)供应关键词：低含量ROX校正染料,WE0142,BaFaSYBR Mixture(Low ROX),快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)


·定影粉
编号：WE0302
英文名称：Fixing Powder
规格：20套

·水产动物基因组提取试剂盒
编号：WE0182
英文名称：Marine Animal DNA Extraction Kit
规格：50次
  本试剂盒适合于从多种水产动物(如鱼类、虾类、贝类等)组织中提取总DNA。纯化过程不需*酚或*仿等有机溶剂，无需乙醇沉淀。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅胶质离心吸附柱上，其他污染物可流过膜，蛋白、PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步有效的洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。

试剂盒组成：

组份	50次
Buffer GTL	15ml
Buffer GL	15ml
Buffer GW1(浓缩液)	13ml
Buffer GW2(浓缩液)	15ml
Buffer GE	15ml
蛋白酶K	25mg
蛋白酶K 储存液	1.25ml
吸附柱DM及收集管	50套

自备试剂：无水乙醇。

实验前准备及重要注意事项/strong>：
1、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。
3、第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
4、使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，Buffer GTL和Buffer GL于56℃水浴重新溶解。
5、如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GTL后加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0225S。

不同水产动物组织提取得率：

样本	建议孵育时间	DNA得率
贝类组织	0.5 h	12-20μg
虾组织	1 h	8-14μg
鱼组织	1 h	15-40μg

操作步骤：
1、取不超过30 mg组织材料，液氮充分研磨后，放入离心管(自备)中，加入200μl Buffer GTL，涡旋振荡15秒。
注意：
1)根据提取的组织不同，起始量也有不同，腮的细胞量较大，一般建议提取量不超过20 mg。
2)如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl 100 mg/ml 的RNase A溶液(货号：WE0225S)，震荡混匀，室温放置5-10分钟。
2、加入20μl 蛋白酶K ，涡旋混匀，简短离心，使管壁上的溶液收集到管底。56℃孵育，直至组织完全溶解，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：不同组织裂解时间不同，通常需0.5-2小时即可完成。对于难裂解组织可以适当延长孵育时间。
3、加入200μl Buffer GL，充分颠倒混匀，70℃孵育10分钟，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：加入Buffer GL时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。
4、加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
5、将步骤4所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。
8、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。
9、将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
注意：
1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。
2)离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
3)用另外的50-200μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
4)如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤9所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤9；若洗脱体积小于200μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用50μl Buffer GE或灭菌水洗脱。
5)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

储存条件：室温(15～30℃)。


快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)供应关键词：低含量ROX校正染料,WE0142,BaFaSYBR Mixture(Low ROX),快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)


·Ni琼脂糖凝胶
编号：WE0272
英文名称：Ni-Agarose Resin
规格：10ml
  该镍柱纯化系统对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6个组*酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+更为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统(如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌)中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接使用，方便，快捷。

支持物：CL-6B琼脂糖凝胶
载量：20-30 mg His标签蛋白/ml填料
粒径：50-160μM

注意事项：
1、缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT或EDTA。
2、整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
3、为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。可以使用线性或梯度浓度的咪唑(20-500 mM)洗脱蛋白，并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
4、为避免柱子被堵塞，请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.45μM过滤器过滤。建议将裂解液进行离心，或者使用0.45μM过滤器过滤。
5、柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

使用方法：

I 缓冲液的准备
1、可溶性蛋白纯化缓冲液配方：

成分	Tris-HCl(PH 7.9)	咪唑	*化*
Soluble Binding Buffer	20 mM	10 mM	0.5 M
Soluble Elution Buffer	20 mM	500 mM	0.5 M

2、包涵体蛋白纯化缓冲液配方：

成分	Tris-HCl(PH 7.9)	咪唑	*化*	尿素/盐*(代"酸")胍
Inclusion Body Binding Buffer	20 mM	5 mM	0.5 M	8 M/6 M
Inclusion Body Elution Buffer	20 mM	500 mM	0.5 M	8 M/6 M

II 组装层析柱
1、将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
注意：
1)填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。
2)本实验是通过重力作用使溶液流出，如果溶液不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使其流出。
2、向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。
注意：柱体积指的是填料的体积。

III 可溶性蛋白的纯化
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入1-5ml细菌裂解液，超声裂解菌体。10000×g离心10分钟后，收集上清。
2、将上清液过柱，流速为10倍柱体积/小时。
3、使用15倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。
4、使用5倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
5、洗脱后，依次使用3倍柱体积的Soluble Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。

Ⅳ 包涵体蛋白的纯化
1、收集菌体后，每100 mg菌体(湿重)加入1-5ml 细菌裂解液，超声裂解菌体。
2、离心，弃上清，将沉淀重悬于Soluble Binding Buffer 中(如有需要，可进行超声波处理，超声前可加入1-5 mM 磷酸酶抑制剂混合物)。
3、重复操作2，直至包涵体清洗干净(呈较洁净的乳白色状)。
4、将沉淀重悬于Inclusion Body Binding Buffer中，冰浴1小时，使包涵体溶解。
5、10000×g离心20分钟，将上清以孔径为0.45μM的滤膜过滤。
6、将蛋白溶液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。
7、使用15倍柱体积的Inclusion Body Binding Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。
8、使用5倍柱体积的Inclusion Body Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
9、洗脱后，依次使用3倍柱体积的Inclusion Body Binding Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，封柱后2～8℃保存。
注意：在纯化包涵体蛋白时，所有缓冲液均含有变性剂，需要降低Binding Buffer中的咪唑浓度(5 mM或更低)。洗脱时，若蛋白在较高pH下洗脱失败，可以选用低pH缓冲液作为洗脱缓冲液(pH6.5，pH5.9或pH4.5)。

Ⅴ 柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有所下降(表现为流速变慢或填料失去蓝绿色)，可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1、使用2倍柱体积的6M盐*(代"酸")胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
2、使用1倍柱体积2% SDS冲洗。
3、依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积100%乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%、25%的乙醇冲洗。
4、使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
5、使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液(PH8.0)冲洗。
6、使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗。
7、封柱后2～8℃保存。
8、再次使用前，需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4再生，3个柱体积的Binding Buffer平衡。

储存条件：2～8℃，避免冷冻

北京百莱博科技有限公司专业生产核酸扩增(PCR)产品，欢迎来电咨询选购快速实时荧光定量PCR预混体系(低含量ROX校正染料)供应。