快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针)(低含量ROX校

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名称：快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针)(低含量ROX校正染料)库存
规格：5ml
英文名：Fast TaqMan Mixture(Low ROX)
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
编号：WE0152
  本品是专用于探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)实时荧光定量PCR的预混体系，浓度为2×,包含Fast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、Mg2+等，操作简单方便。主要用于基因组DNA靶序列和RNA反转录后的cDNA靶序列检测。本品含有的Fast Taq DNA Polymerase，能有效减少在常温条件下由引物和模板非特异性结合或引物二聚体而产生的非特异性扩增，酶的激活仅需在95℃孵育30s。整个PCR反应过程比普通反应可节省约40分钟，大大缩短了PCR的反应时间。独特的PCR缓冲体系与快速热启动酶的组合，有效抑制了非特异产物的产生，并显著提高了PCR的扩增效率，荧光信号更强，灵敏度更高，线性范围更宽。该产品适用范围广，可用于普通和快速定量PCR程序。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器(WE0151)：
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器(WE0152)：
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器(WE0153)：
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

试剂盒组成：

 

组份	WE0151-5ml	WE0152-5ml	WE0153-5ml
2×Fast TaqMan Mixture	5×1ml	5×1ml	5×1ml
50×Low ROX	-	200μl	-
50×High ROX	-	-	200μl
ddH2O	5×1ml	5×1ml	5×1ml

注意事项：
1、使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降。本产品长期保存可置于-20℃，避光。如果在短期内需要频繁使用，可在2～8℃保存。

使用方法：
以下举例为常规PCR反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。

1、PCR反应体系

试剂	50μl反应体系	终浓度
2×Fast TaqMan Mixture(With ROX)	25μl	1×
Forward Primer，10μM	1μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	1μl	0.2μM
Probe，10μM	1μl	0.2μM
Template DNA	2μl
50×Low ROX or High ROX(可选)	1μl	1×
ddH2O	up to 50μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)所用探针的终浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常DNA模板的量以10-100ng基因组DNA或1-10ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50× Low ROX or 50×High ROX。

2、PCR反应程序：
建议采用两步法PCR反应程序，本程序是以ABI 7500荧光定量PCR仪为参照设定。
 

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	30 s
变性	95℃	5 s	35-40 个循环
退火/延伸	60℃	30 s

注意：
1)本产品所采用的酶须在预变性95℃、30s条件下实现酶的活化。在此条件下，大多数模板可良好的进行解链。对GC含量高、二级结构复杂的模板，可将预变性时间延长至1-4分钟，以使起始模板充分解链。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

更多有关快速实时荧光定量PCR的预混体系(荧光探针)(低含量ROX校正染料)库存的价格及使用说明等，请联系我们的业务经理王欣女士咨询，我公司还销*(代"售")以下产品：
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·封闭用正常山羊血清工作液(免疫组化封闭液)
编号：WE0320
英文名称：Normal Goat Serum For Blocking
规格：10ml
  正常血清是目前广泛使用的免疫学试验中的封闭及保护试剂。使用正常血清封闭可预先饱和组织切片对蛋白物质的物理吸附位点，从而大大减少组织对检测抗体的非特异性吸附。本封闭液采用优质正常山羊血清为原料，加入稳定剂和蛋白保护剂，可有效的的封闭组织上能与抗体非特异结合的位点，从而减少IHC实验的非特异染色，显著的降低背景。

注意事项：
1、如所用的一抗为山羊来源的(Goat anti-)，请避免使用该封闭液，否则可能造成更多非特异着色。
2、以每张切片加入1滴(约50μl)计算，10ml可做200张切片。
3、为了获得实验最佳效果，请根据实验调整最佳使用量。
4、本产品仅用于诊断和科研，不能用于人体实验或人体治疗。

操作步骤：

1、常规处理欲检测的石蜡或冰冻组织切片或细胞爬片等样本。
2、滴加适量内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10分钟，PBS充分淋洗。
3、滴加适量封闭用正常山羊血清工作液(免疫组化封闭液)，室温孵育10分钟，甩干。
4、进行后续的一抗孵育等IHC染色步骤。

储存条件：2～8℃

·RIPA裂解液(强)
编号：WE0258
英文名称：RIPA Lysis Buffer(Strong)
规格：100ml
  RIPA裂解液是一种传统的组织以及细胞快速裂解液，主要用于从动物组织和哺乳动物细胞中抽取可溶性蛋白，可用于裂解贴壁细胞和悬浮细胞。按照其裂解液的强度可以分为强、中、弱三类，具体特点和差异请参考附表2，可根据实验需求选择相应产品。RIPA裂解液(强)可以有效提取细胞核、细胞膜和胞浆蛋白，提取的蛋白可应用于蛋白定量、Western Blot、IP等检测分析。
  RIPA裂解液(强)的主要成分为50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1%Triton X-100，1% sodiu*(代"m") deoxycholate，0.1% SDS以及sodiu*(代"m") orthovanadate，sodiu*(代"m") fluoride，EDTA，leupeptin等。


注意事项：
1、为防止蛋白降解，所有的操作尽量在冰上进行。
2、使用RIPA裂解液得到的蛋白样品，可采用BCA法进行蛋白定量，以测定蛋白浓度。产品可单独向本公司订购，如：WE0276 BCA蛋白定量试剂盒。本品含有高浓度的去垢剂，不能用Bradford法进行蛋白定量。
3、建议在使用RIPA裂解液前，向溶液中加入蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，以防止蛋白降解，或保持蛋白的磷酸化状态。产品可单独向本公司订购，如：WE0259 蛋白酶抑制剂混合物，WE0256 磷酸酶抑制剂混合物。
4、若需获得更高浓度的蛋白，应减少哺乳动物蛋白抽提试剂的使用量。
5、对于培养瓶中的贴壁细胞，推荐先使用常规方法消化细胞，再参考悬浮细胞蛋白提取步骤操作。
6、对于离心获得的细胞，若不确定细胞体积，可根据细胞数量计算RIPA裂解液的使用量。如5×106个Hela细胞约需加入500μl RIPA裂解液，以此类推。

使用方法：

一、细胞样品
贴壁细胞蛋白抽提
1、小心倾去贴壁细胞的培养液。
2、可选步骤：若培养基中含有酚红或其他可能影响实验结果的物质，请先使用预冷的PBS漂洗细胞。
3．加入适量RIPA Lysis Buffer(Strong)(使用前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂)，试剂使用量请参考附表1，在冰上用枪头吹打贴壁细胞。

表1 贴壁细胞RIPA 裂解液使用量推荐表

细胞培养板类型或培养面积	RIPA 裂解液使用量
100 mm	500-1000μl
60 mm	250-500μl
6孔培养板	200-400μl /孔
24孔培养板	100-200μl /孔
96孔培养板	50-100μl /孔

4、将裂解液转移至新的离心管中，冰上孵育20分钟，使细胞充分裂解。
5、14000×g离心10分钟。转移上清液至新管中，进行下一步分析。

悬浮细胞蛋白提取
1、悬浮细胞，2,500×g离心5分钟，弃去上清。
2、可选步骤：若培养基中含有酚红或其他可能影响实验结果的物质，请使用PBS漂洗细胞。漂洗后的细胞悬浮液2,500×g离心5分钟，弃去上清。
3、加入适量RIPA Lysis Buffer(Strong)(使用前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂)，每5×106细胞加入约200-500μl RIPA Lysis Buffer(Strong)，吹打均匀。
4、冰上放置20分钟，使细胞充分裂解。
5、14000×g离心10分钟。转移上清液至新管中，进行下一步分析。

二、组织样品
1、取适当的RIPA Lysis Buffer(Strong)，在使用前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂。
2、称量实验组织的重量，按照1:10(g/ml)的比例加入RIPA Lysis Buffer(Strong)后将组织剪成细小碎片，用电动匀浆器匀浆处理。若需要浓缩的蛋白提取物，可适当减少组织蛋白抽提试剂使用量。
3、冰上孵育20分钟，使细胞充分裂解。
4、14000×g 离心10分钟。转移上清液至新管中，进行下一步分析。
注：RIPA裂解液的裂解产物中可能会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为基因组。

表2 蛋白裂解液性能、参数比较
 

目录号	WE0258	WE0257
名称	RIPA裂解液(强)	RIPA裂解液(中)	RIPA裂解液(弱)	SDS裂解液
裂解强度	强	中	温和	强
有效裂解成分	1%Triton X-100， 1%脱氧胆酸*, 0.1% SDS	1% NP-40， 0.5%脱氧胆酸* , 0.1% SDS	1% NP-40， 0.25%脱氧胆酸*	1%SDS
膜蛋白提取	很好	较好	一般	很好
胞浆蛋白提取	很好	很好	很好	很好
核蛋白提取	很好	较好	较好	很好
主要用途	WB，IP	WB，IP	WB，IP，CO-IP	WB，CHIP

储存条件：2～8℃

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