- ¥900 - 2100
- 江蓝纯
- S4530
- 2025年07月13日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
99
- 供应商：
江蓝纯
- 规格：
5ml/25ml
| 规格： | 5ml | 产品价格： | ¥900.0 |
|---|---|---|---|
| 规格： | 25ml | 产品价格： | ¥2100.0 |
产品性能：
| 性能 | 指标 |
| 基质 | 4%琼脂糖微球 |
| 配体 | 碘乙酸 |
| 载量 | ＞3mg |
| 粒径(μm) | 45-165 |
| 大流速 | 0.1MPa |
| pH | 稳定范围 |
| 储存缓冲液 | 1M NaCl |
SulfoLink Coupling Resin 针对巯基和氨基的偶联条件有所差异，对于含有巯基抗原偶联请参考1.1 流程，对于含有氨基抗原偶联请参考1.2 流程。
1.1 含巯基抗原的偶联流程
1.1.1 缓冲液准备
所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22 μm 或0.45 μm 滤膜过滤。
偶联液：50 mMTris，5 mMEDTA-Na，pH 8.5
封闭液：50 mMTris，5 mMEDTA-Na，50 mML-半胱氨酸，pH 8.5
保护液：20 mM 磷酸盐缓冲液，20% 乙醇，pH 8.0
结合/洗杂液： 20 mM 磷酸盐缓冲液，pH 8.0
洗脱液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0
中和液：1 M Tris-HCl， pH 8.5
1.1.2 抗原准备
抗原样品使用前务必确保其巯基处于还原状态（可以使用Ellman’s Reagent 检测自由巯基的含量）。如果巯基已经氧化，必须对抗原进行还原，一般推荐使用还原剂TCEP（Tris(2-carboxyethyl) phosphine），TCEP 溶液很稳定，可以选择性的、高效的打开抗原中的二硫键，并且不影响抗原与树脂的偶联反应，每毫克抗原中TCEP 的添加量不超过12mg，需要自己进行优化。如果使用DTT 等含有巯基的还原剂，处理完样品必须要将还原剂去除，否则会影响抗原与树脂的偶联效率。使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为1-3 mg/ml 的抗原溶液。建议该溶液现用现配，储存时间过长会影响偶联效果。
1.1.3 抗原偶联
1) 取适量的SulfoLink Coupling Resin，加入合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3 倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9 倍柱体积的偶联液。
2) 关闭柱子的下端出口，加入等体积的含巯基的抗原，混匀，取出至于合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。
3) 将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出，再用3 倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出。
注：如有需要，可以使用Ellman’s Reagent 检测其中巯基含量，得出抗原残留量，从而计算偶联效率。
4) 关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
5) 将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。
注：如果立即使用，可以参考1.1.4 操作。如果以后使用，可以用3 倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于2℃-8℃保存。
1.1.4 抗体纯化
1) 将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5 倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。
2) 将含有抗体的样品加到平衡树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。
3) 用10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。
4) 使用5-10 倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。
注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0 的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。
5) 依次使用3 倍柱体积的结合液和5 倍柱体积的去离子水平衡树脂，后再用5 倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于2℃-8℃保存，防止填料被细菌污染。
1.2 含氨基抗原偶联流程
1.2.1 缓冲液准备
所用水和Buffer 在使用之前建议用0.22 μm 或0.45 μm 滤膜过滤。
偶联液：0.1MNaHCO3，0.5MNaCl，pH 8.5
封闭液：50 mMTris， 5 mMEDTA-Na， 50 mML-半胱氨酸，pH 8.5
保护液：20 mM 磷酸盐缓冲液，20% 乙醇，pH 8.0
结合/洗杂液: 20 mM 磷酸盐缓冲液，pH 8.0
洗脱液: 100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0
中和液：1 M Tris-HCl， pH 8.5
1.2.2 抗原准备
氨基是一种比较稳定的基团，所以，对于含有氨基的抗原没有太特殊的要求。使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为5-10 mg/ml的抗原溶液。
1.2.3 抗原偶联
1) 取适量的SulfoLink Coupling Resin，加入合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3 倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9 倍柱体积的偶联液。
2) 关闭柱子的下端出口，加入等体积的含氨基的抗原，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育3-5 小时，或者2-8℃震荡孵育过夜（12-15 小时）。
注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。
3) 将上述反应体系取出，转移至重力柱中，其中的抗原溶液，并收集流出，再用3 倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出，留待测试。
4) 关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
5) 将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。
注：如果立即使用，可以参考1.2.4 操作。如果以后使用，可以用3 倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于2℃-8℃保存。
1.2.4 抗体纯化
1) 将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5 倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。
2) 将含有抗体的样品加到平衡树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。
3) 用10-15 倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。
4) 使用5-10 倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。
注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH 7.0-8.0 的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。
5) 依次使用3 倍柱体积的结合液和5 倍柱体积的去离子水平衡树脂，后再用5 倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于2℃-8℃保存，防止填料被细菌污染。
1.3 SDS-PAGE 检测
将纯化抗体样品得到的流出组分、洗杂组分和洗脱组分以及原始含抗体样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
问题及解决方案
| 问题 | 原因分析 | 推荐解决方案 |
| 柱子流速低 | 筛板被堵塞 | 清洗或更换筛板 |
| 样品或填料中有气泡 | 轻轻搅拌填料或敲击层析柱去除气泡 | |
| 偶联液中蛋白或多肽沉淀 | 蛋白或多肽不溶 | 偶联液中加入小于30%的DMSO或DMF或6M 盐酸胍促进样品溶解 |
| 偶联效率低 | 样品无巯基被氧化 | 加入DTT或TCEP 后立即交联 |
| 洗脱组分纯度低 | 树脂没有彻底清洗 | 增加结合/洗杂液体积 |
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