甲基化专一性PCR试剂盒库存

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百奥莱博专业生产销*(代"售")甲基化专一性PCR试剂盒库存，我公司供应的分子生物学试剂品类齐全，且具有优势价格，欢迎新老客户垂询订购。

名称：甲基化专一性PCR试剂盒库存
编号：BTN100923
规格：50次
产地：国产|进口
品牌：百奥莱博
英文名：Methylation Specific PCR Kit
本产品是基于PCR的甲基化DNA检测试剂盒(即MSP试剂盒)。它由两个成分组成，一个是亚硫*(代"酸")*盐试剂盒，用于将DNA中所有没有甲基化的C转化成U，而甲基化的C不变。二是优化的PCR试剂盒，利用客户自备的专一性引物，根据PCR来检测甲基化位点的位置。

产品特点：
1．本产品是亚硫*(代"酸")盐修饰试剂盒和即用型PCR 3.0的整合，即开即用，非常方便。
2．柱式DNA回收方法极大提高亚硫*(代"酸")盐修饰后DNA的回收率。
3．优化的PCR mix，含有PCR所需要的所有成分，减少了操作误差。
4．PCR结束后可以直接上样电泳，非常方便。
5．用户需要自备MSP专一性引物。

试剂盒组成：

 

成分	规格
溶液A	5ml
溶液B成分一(干粉)	2.3g×5瓶
溶液B成分二(干粉)	110mg×5瓶
通用溶胶液	50mL×2
离心吸附柱	50套×2
通用洗柱液	100mL
DNA洗脱液	10mL
PCR MagicMix 3.0	1.5mL
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存(PCR MagicMix 3.0要低温运输，-20℃保存)，有效期一年。

自备试剂：超纯水、MSP引物、对照DNA模板和引物。
 注：严格的实验一般要求下列5种对照DNA模板和相应的引物对，用户可以根据自身实验的要求只做其中的部分。

对照名称	起始DNA	处理
未修饰未甲基化DNA对照	未甲基化DNA (无甲基化宿主菌或体外扩增而得)	未经过亚硫*(代"酸")*盐修饰
已修饰未甲基化DNA对照	未甲基化DNA(同上)	经过亚硫*(代"酸")*盐修饰
未修饰甲基化DNA对照	甲基化DNA (用甲基化酶修饰未甲基化DNA而得)	未经过亚硫*(代"酸")*盐修饰
已修饰甲基化DNA对照	甲基化DNA(同上)	经过亚硫*(代"酸")*盐修饰
未修饰样品DNA对照	样品DNA	未经过亚硫*(代"酸")*盐修饰

使用方法：

Ⅰ．亚硫*(代"酸")*盐修饰
一、准备试剂
1．配制溶液B成分一溶液：加5.0mL超纯水和27μl溶液A到装有溶液B成分一干粉的棕色塑料瓶中，轻柔摇晃至溶(尽量少的剧烈摇晃，约需要5分钟)，总体积约5.5mL。
2．配制溶液B成分二溶液：加10mL超纯水到装有溶液B成分二干粉的棕色塑料瓶中，轻柔摇晃混匀(尽量少的剧烈摇晃)。
3．配制溶液B工作液：将55μL溶液B成分二溶液加入到溶液B成分一溶液中，轻柔颠倒混匀即可使用。一瓶溶液B工作液可以用10次。
二、DNA变性处理
1．将5μL溶液A加入到45μL DNA溶液中并吹打混匀(总体积没有45μL需要用水补足到45μL，DNA总量在0.2-5μg之间，不能超过 5μg，一般使用2μg DNA即可)。 注意：DNA必须是线状的，长度最好在20-50 Kb左右。基因组DNA可以预先用酶切处理(酶的位点不得在研究的DNA序列之内)，也可以用机械打断法处理(得到的DNA一般在20-50 Kb左右)。
2．37℃放置15分钟使DNA充分变性。
3．立即在DNA溶液中加入500μl溶液B工作液，轻柔颠倒混匀。
4．55℃避光保温8-16小时。如果使用水浴或没有热盖的PCR仪器保温，最好加50-100μL石蜡油，避免水分蒸发。
 注意：必须避光保温。55℃处理8小时足以使95%的C变成U，保温时间过长会引起DNA的断裂。如果有的区域的C难以转化成U，可以改用两步式PCR处理(每55℃保温3小时后95℃变性处理5分钟，共5-10个循环)，效果会更佳。
5．冰浴10分钟。
6．加入1mL的通用溶胶液，颠倒混匀后取一半溶液上柱。单链DNA会结合在离心吸附柱上，亚硫*(代"酸")*盐等将穿透过柱。
7．12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。
8．取另一半溶液再上柱，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。单链DNA会结合在离心吸附柱上，亚硫*(代"酸")*盐等将穿透过柱。
9．加入0.7mL通用洗柱液，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。此步可以洗涤残留的亚硫*(代"酸")*盐。
10．干甩半分钟后，将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50μl新鲜配制的溶液A稀释液(5μl的溶液A原液与45μl的超纯水混合而得)，室温放置2分钟后离心半分钟。
11．将洗脱下来的DNA溶液放置在37℃保温15分钟。
12．加入0.7mL的通用溶胶液，混匀后上柱。
13．12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。单链DNA会结合在离心吸附柱上，杂质等将穿透过柱。
14．干甩半分钟后，将离心吸附柱转移到一个新的离心管中，加入50μl DNA洗脱液，室温放置2分钟后离心半分钟。
15．所得溶液即为亚硫*(代"酸")*盐修饰的DNA，可以用于下面的甲基化专一PCR。
 说明：此方法的回收率一般为50%，2μg DNA最后可以得到1μg的修饰后的DNA。由于修饰后的DNA呈长短不一的单链，EB染色效果很差，所以不能用灵敏度低的琼脂糖电泳-EB染色的方法检测，但可以用灵敏度更高的PAGE-银染方法检测。

Ⅱ．甲基化专一性PCR(以60μL的标准PCR反应体系为例)
1．在一干净的PCR管中，加入下列成分(冰上操作)：

成分	样品管	对照管
PCR MagicMix 3.0	30μl	30μl
亚硫*(代"酸")*盐修饰的DNA模板	100-500ng	无
对照DNA模板	无	100-500ng
自备MSP引物F	25pmol	无
自备MSP引物R	25pmol	无
对照模板专一性PCR引物F	无	25pmol
对照模板专一性PCR引物R	无	25pmol
补水到	60μl	60μl

 注：有5种对照DNA模板可以供用户根据自身需要选择，详见自备试剂栏。
2．将混合物混匀，放入PCR仪中进行热启动PCR，结束后取5-10μL PCR产品直接进行琼脂糖电泳。

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·Tris盐*(代"酸")溶液(1M,pH9.0)(不含RNase)
编号：BTN80933
英文名称：RNase-Free Tris-HCl Solution
规格：250mL

·链激酶
编号：BTN131183
英文名称：Streptokinase
规格：10kU
链激酶，又名溶栓酶，是由β-溶血性链球菌产生的一种酶。其能与血浆纤溶酶原结合成复合物，使其暴露活性部位，催化纤溶酶原转化为纤溶酶，使血栓溶解。但不能溶解形成已久且已机化的血栓。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

·Zamboni固定液
编号：BTN140105
英文名称：Zamboni Fixative Solution
规格：250mL
本产品主要由多聚甲醛、饱和苦味*(代"酸")、磷酸盐等组成，是常用的混合型固定液之一。本产品适用于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醇为优，固定均匀，组织收缩轻微，对细胞的微细结构显示的很清晰，为一种良好的固定液。

固定液分为醛类固定液、汞类固定液、醇类固定液、氧化剂类固定液、苦味*(代"酸")盐类固定液等，较为常用的是醛类中的福尔马林、醇类中的乙醇。固定的目的在于保存细胞和组织的原有形态结构，固定剂能阻止内源性溶酶体酶对自身组织和细胞的自溶、抑制细菌和霉菌的生长。

储存条件：常温运输及保存，保存期为一年。

使用方法：(按具体实验要求具体操作，以下内容仅供参考)
1．一般需固定30～60分钟。如果组织块大，可适当延长固定时间，但不宜超过24h。
2．固定后组织可稍微流水冲洗或不冲洗直接转入70%的乙醇脱水，经乙醇脱水后组织留有一点黄色，对染色无影响。

注意事项：
1．本产品对人体有一定的损害，请在通风好的环境下小心操作，避免吸入。
2．组织取材的厚度不同，固定时间也不同，对组织恰当的选材有利于固定液的渗透。
3．固定液的容量应足够，一般固定液与组织块的体积比率应大于10:1。如果容积不够大，可以在固定期间更换1～3次固定液。
4．温度对固定的影响很明显，提高温度可以加速固定作用，但温度不宜过高。
5．取出新鲜组织后，应及时固定，无法及时固定时，应保存于生理盐水中及时送检。
6．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。


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·琼脂糖
编号：BTN81105
英文名称：Agarose
规格：100g
琼脂糖电泳是核酸分析的最重要的方法之一，本产品可以满足大部分常规核酸电泳的要求，包括PCR电泳、质粒电泳、RNA电泳等等。产品透明度好，溶解快，胶液清澈透明；强度高，保证凝胶的强度与弹性，即使是低浓度的凝胶也不易发生破碎。低电内渗，减少对电泳质迁物迁移与分离的影响。极低的背景，没有其它荧光物质干扰，泳带与背景黑白分明，拍摄的图片效果好。没有核酸酶和蛋白酶污染。

储存条件：常温运输及保存。有效期两年。

·非变性法蛋白沉淀试剂盒
编号：BTN81029
英文名称：Non-Denaturing Protein Precipitation Kit
规格：10次
本产品是基于蛋白质盐析和透析原理开发的非变性蛋白质浓缩产品。其原理是将大量具有很强水化能力的硫*(代"酸")铵加到蛋白质溶液中，夺取蛋白质分子的水化层(尤其是蛋白质表面非极性区的水化层)，使之“失水”，于是蛋白质分子间的非极性基团将互相结合，使蛋白质形成沉淀，离心分离沉淀后，再用透析方法将蛋白质中的盐除去，即得浓缩的蛋白质。

产品特点：
1.适合于浓缩各种蛋白质粗提液，一次可以处理50mL蛋白质溶液。
2. 非变性法，不会破坏蛋白质的天然结构和活性，尤其是适用于对变性敏感的酶溶液。
3. 得到的蛋白质结构稳定，适合于长期保存。
4.可以在透析是进行缓冲液的调换。
5.一站式，带有盐析和透析所需的物品。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	50ml×10
无菌水	50ml
EDTA溶液(0.5M)	0.5ml
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存，有效期一年。

使用方法：
注意：除对温度敏感的蛋白质样品需在4℃环境下(如冷室)操作外，一般可在室温中操作，操作者整个操作须戴好手套。

盐析沉淀
1．测量待浓缩蛋白质样品的体积，并将其转移到容积至少是样品体积两到三倍的无菌烧杯或玻璃三角瓶中。注意：需要处理的蛋白质样品最好溶解在pH为中性的缓冲液中(如50mM的Tris-HCl)，浓度最好在1mg/mL以上。
2．将一个无菌的磁力搅拌子放入三角瓶中，再将三角瓶放置在磁力搅拌器上，打开开关后缓慢搅拌。注意：搅拌过程中不能产生泡沫。
3．如果待浓缩蛋白容易被金属离子失活或抑制，则最好加入EDTA溶液，使其终浓度为10mM，否则此步可省略。
4．根据所需硫*(代"酸")铵的饱和度计算需要加入的溶液A的体积，溶液A的硫*(代"酸")铵饱和度是100%。一般50%的硫*(代"酸")铵饱和度就可以沉淀绝大部分蛋白，超过此饱和度溶液比重很大，难以通过离心收集蛋白质沉淀。
5．小心缓慢加入所需的溶液A(用前需要摇匀)。注意：最好每次少量加入，切莫一下倒入，否则蛋白质容易变性。混合过程中，蛋白质沉淀可能会使溶液呈牛奶状，属于正常现象。
6．将所需溶液A全部加入后，冰上放置60分钟或过夜让蛋白质充分沉淀。
 注意：血红蛋白、肌红蛋白和清蛋白等在较高的温度25℃比在0℃度时溶解度低，更容易盐析，所以浓缩这些样品时冰浴放置可以改为室温放置。有的蛋白质15-20分钟就可以完全沉淀，有的则需要数小时。
7．将溶液轻移到旋盖塑料离心管或离心瓶中，在平衡条件下15000×g 4℃离心15分钟。
 注意：溶液比重很大，一定要重量上平衡而非体积平衡。
8．小心弃上清，得到蛋白质沉淀。此沉淀可以在4℃放置数月。
9．将尽可能少的无菌水或其他缓冲液加入蛋白质沉淀中使之溶解，所加体积一般是沉淀物体积的1-2倍。如果沉淀溶解后非常粘稠，可以适当补加无菌水使其变得不粘稠。此沉淀可以在4℃放置几天。
10．如果溶液中有不溶物(主要是变性的蛋白质)，可以15000×g 4℃离心15分钟，留上清。
11．上清液可以用于SDS-PAGE电泳检测或UV法蛋白质浓度测定。
12．如果后续纯化方法是疏水层析或排阻层析，则不需要将溶液中残留的盐去掉，可以直接使用。如果后续纯化是离子交换层析，则需要将溶液中残留的盐去掉，一般采用透析法，具体操作见附一。

附一：透析脱盐
1．将蛋白溶液转移到一端已经封口的透析袋内，预留一些液体膨胀的空间，然后将另一端封口。注意：用户需要预处理透析袋，预处理的方法是将透析袋在含2%(W/V)碳酸**和1mM EDTA的溶液中煮沸10分钟，用蒸馏水彻底清洗透析袋，然后放在1mM EDTA的溶液中煮沸10分钟并浸没在此溶液中冷却，最后放4℃保存待用。取用时必须要戴手套。
2．将透析袋放置在装有透析液的容器中，透析液的体积必须是蛋白质溶液的20-100倍，溶液最好处于搅拌状态。用户可以用适合后续实验的任何缓冲液作为透析液。每次透析3-4小时，共透析2-3次。可以用自备的*氏试剂检测透析袋外面溶液是否还有残留的铵离子来检测透析是否完成。
3．将透析后的溶液全部转移到离心管中，15000×g 4℃离心15分钟，上清液即为浓缩后的蛋白溶液。可以放-80℃冰箱保存或立即用于后续的实验。
4．如果需要快速测定蛋白质的浓度，可取少许样品作适当倍数稀释后，用紫外分光光计测280nm和260nm的光吸收，再计算其浓度，计算公式为：蛋白浓度(mg/mL)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×样品稀释度。

附二：多克隆抗体的浓缩
1．将待处理的血清样品在4℃或室温20000×g离心30分钟，收集上清。
2．取上清20mL与等体积的自备生理盐水混合后，于搅拌下缓慢滴加40mL溶液A。
 注：加等量生理盐水的目的是将蛋白质含量降低到2.5-3.0%，否则其他蛋白质会跟抗体一起共沉淀。
3．冰上放置30分钟以上或过夜，使蛋白质充分沉淀。
4．将溶液转移到旋盖塑料离心管中，15000×g 4℃离心10分钟，弃上清。
5．用12mL自备生理盐水溶解蛋白质沉淀。
6．于搅拌下缓慢滴加8mL溶液A，冰上放置1小时使蛋白充分沉淀。
7．将溶液转移到旋盖塑料离心管中，15000×g 4℃离心10分钟，弃上清。
8．用13.3mL 生理盐水溶解蛋白质沉淀。
9．于搅拌下缓慢滴加6.6mL溶液A，冰上放置1小时使蛋白充分沉淀。
10．将溶液轻移到旋盖塑料离心管中，15000×g 4℃离心10分钟，弃上清。
11．用少许生理盐水溶解蛋白质沉淀，并转移到透析袋中。
12．用大于20-100倍体积的PBS 于4℃对蛋白质溶液进行透析，更换透析液数次，然后让蛋白质溶液置-80℃保存或用其他方法进一步纯化。


甲基化专一性PCR试剂盒库存关键词：BTN100923,Methylation Specific PCR Kit,甲基化专一性PCR试剂盒

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